【毕业学位论文】（Word原稿）柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究

兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 1 第一章 文献综述 皮素的来源 黄酮类化合物 (一个含有多酚类 的化学物质 ，以游离态形式或者与糖结合成苷的形式存在。 很早之前， 人类就已经意识到黄酮类化合物具有很多的 药理活性，但直到近代人们才开始研究它们的药理活性、代谢途径等，有关黄酮类化合物种类及应用方面的研究 还 有很多问题亟待解决 (2004)。 柚皮素 (是一种重要的黄酮类化合物，化学名称为 4,5,7 是 柚皮苷 （ 的苷元 ，具有抗氧化、抗炎、抑菌等生理活性，近年来备受重视 (1996)。柚皮素及柚皮苷主要存在于芸香科柑橘属植物的茎、叶、或果实中。 (1995)。其外观为白色针状结晶，溶于乙醇、乙醚和苯，几乎不溶于水。柚皮素 生产工艺主要由醇提、萃取、层析、结晶等工序完成。 目前提取柚皮素的主要方法是 萃取法和柚皮苷水解法 。 刘亚萍从化橘红（芸香科植物华州柚的未成熟果皮）里提取出柚皮苷，采用双蒸水作为溶剂、浓硫酸 作 为催化剂，把精制提取出的柚皮苷完全水解， 可以 得到 高纯度的柚皮素 (刘亚萍， 2008)， 其化 学结构如图 1 所示。 图 1 柚皮素的化学结构式 （ 72g/ of 72g/ 皮素药理活性 柚皮素具有多种药理活性，是黄酮 类化合物 中一个具有代表性的药物。 肿瘤 近年来，科学家们在类黄酮化合物上的着力点是它 们 的抗肿瘤活性，相关研究也是围绕着抗肿瘤活性展开的。 为柚皮素 通过 抑制肿瘤细胞 各个 阶段 的细胞 增殖发挥抗癌作用 (1983)；李瑞芳等研究了柚皮素对人 慢性骨髓性系白血病细兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 2 胞株 （ 的作用机制及生长影响。初步研究表明，柚皮素可以明显抑制 胞的增殖，并说明了 其 作用机理可能是柚皮素阻滞 了 胞周期进程，并诱导了细胞凋亡 (李瑞芳 ， 2007)。 郭国超等研究了柚皮素衍生物的合成 ， 首先以碘甲烷为甲基化试剂、碳酸钾为缩合试剂进行了烷基化反应，得到 7,4后以硫酸为催化剂、乙酸酐为酰化试剂进行了酯化反应，制备出了 5,7， 4这 两种衍生物对人源肝 肿瘤细胞 1 的 抑制率 分别 为 (郭国超 ， 2010)。 复功能 证明了柚皮素可以修复氧化受损的前列腺癌细胞的 其 在坏死状态下得 以 激活而复生 (2006)；李桃园 等 认为柚皮素不 仅 可以减轻 致的急性肝损伤中的氧化应激反应，并且 可 以显著性降低肝脏细胞核 单链断裂氧化损伤水平 (李桃园 ， 2010)。 氧化、抗衰老 在 前人的研究基础之上， 近期柚皮素的 抗氧化作用 研究 成为焦点 。 认为柚皮素具有抗氧化、抗衰老的作用 (1986)； 究发现柚皮素的抗氧化能力可渗透到脂质双分子层中 ，并 借助模式生物对柚皮素的抗氧化 、 延缓衰老作用展开了讨论 (1995)。 保护功能 过大鼠实验，发现柚皮素能够降低血浆与肝脏中胆固醇的浓聚水平 (1999)。通过小鼠实验，宋紫辉发现了柚皮素对急性免疫性肝损伤具有保护作用，柚皮素直接抑制了 T 淋巴细胞的激活，并且阻止了许多炎症因子分泌，从而减轻了小鼠急性免疫性肝损伤 (宋紫辉 ， 2009)。柚皮素还能 有效 降低肝炎 C 病毒 感染的 肝脏细胞数量 ，起到有效 的肝脏保护作用 (2008)。 它活性 现柚皮素可以增加雌激素受体的浓度，发挥 起作用并 促进子宫发育 (2004)。有 研究表明，柚皮素具有抑菌 活性， 对大肠杆菌、金黄葡萄球菌等细菌和真菌有很强的抑制作用 (2008)。 化学物质 ， 如巴豆油、二甲苯等 ， 可引起急性炎症 ， 表现为局部充血 ， 水肿等炎症反应。若将这些物质涂于小鼠耳部 ， 可诱导其耳部肿胀 ， 抗炎药物可使肿胀减轻甚至消除。通过该药效方法 ， 人通过实验发现 ，以小鼠耳片重量差为指 标的抗炎作用看 ， 柚皮素抗炎作用随剂量增加 ， 抗炎作用增强 ， 高剂量组效果最好 ， 抑制率达 38%左右。以小鼠耳片厚度差为指标的抗炎作用看 , 柚皮素抗炎作用随剂量增加 ， 抗炎作用增强 ， 高剂量组抑制率达 结果说明 ， 柚皮素各剂量组均有抗炎效果 ， 随剂量增加 ， 抗炎效果增加 ，具有良好的抗炎作用 (1994)。 以 明显地减小细胞色素 的活性，抑制多种药物在体内的代谢(2001)。 此外， 柚皮素金属配合物体外亦显示出较强的抗氧化活性 (2006)兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 3 及修复 能力 (i, 2007)。但 是，目前有关柚皮素 环糊精衍生物类包合物和金属 配合物的 生物 活性却从未报道过。 皮素 其它应用价值 柚皮素具有重要的生物活性 ，不但 应用于医学 中，还在 化工、食品及农业等领域广泛 应用 (吕爱新 ， 2011)。 工领域中的应用 分子印迹聚合物，是一种新型高分子材料，对模板分子的识别具有“预定”能力，在仿生传感器、手性物质拆分、生物分离、抗体模拟、酶催化模拟等领域中具有不可比拟的应用前景。郑细 鸣 在开发高分子材料过程中，以柚皮 素为模板分子 、 乙二醇二甲基的丙烯酸甲酯为交联试剂 、 氯丙烯酰胺为功能单体，研究单步溶个胀聚合的方法制备了单分散的分子印迹之聚合物微球 （ 。 这种特殊的微球对于模版分子具有很强的特异吸附能力 (郑细鸣 ， 2006)。 品领域中 的应用 柚皮素可被 用 做食品的香料添加剂，常 被 用于苦味、辣味食品以及食用油的 矫味 。 从西班牙出产的柠檬和橄榄中提取 柚皮素 ，并把它作为一种功能型的食品添加剂 ； 在此后的系列研究中发现， 它 可 用于 治疗由 于 血液 中 胆固醇与甘油三酯 过高所 引起的疾病 (2010)。 业领域中 的应用 类黄酮物质具有抗菌和酶抑制等作用。 取有机溶剂萃取 方法 在 日本出产的赤小豆、芸豆、绿豆、豇豆等食用豆科植物中，提取了柚皮素类的衍生物 。研究表明， 它们 都可以制作成杀虫剂，可以较好地防治豆象等害虫 ， 是一种新型的 、 环境友好 的 生物农药，具有极为重要的应用价值 (2004)。 皮素剂型与临床应用进展 柚皮素无论是制备成片剂还是胶囊剂，都普遍存在着体外溶出度和生物利用度方面不够理想的问题 ，以其 作为 单独 活性成分的药物 处 方 或制剂，国内外鲜有报 道 。 国内 已 有专利申请柚皮素的片剂， 提示该制剂 可增高肝细胞的微粒体酶的活性，加速肝的解 毒 能力；降低四氯化碳引起的大鼠血清谷 同时 还可降低四氯化碳、鬼笔碱、硫化乙酰胺、猪屎豆碱等肝脏毒物引起的各种类型的肝损伤的细胞膜，而达到明显的肝脏保护作用。 加药物溶解度和生物利用度的方法 针对难溶性药物口服给药生物利用度低、难以制成水溶剂液体制剂等问题，国内外药学工作者进 行了大量的探索和研究。目前增加难溶性药物溶解度的传统手段，多采用超细粉碎、成盐、添加增溶剂、助溶剂等措施 (崔福德 ， 2003)。除此之外，主要就是通过改变难溶性药物的分子结构、选用合适药物晶型、采用包合技术、或采用合适的载体和制剂兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 4 技术改善药物理化性质，提高其与胃肠道黏膜的亲和性和透过性，促进其口服吸收 (朱盛山 ，2003； 陆彬 ， 2005) 成水溶性前体药物 合成水溶性前体药物主要是通过成酯、成盐、或进行分子结构修饰形成以共价键结合亲水性大 分子。通过前体药物增加难溶性药物的水溶性，促进其在胃肠道的吸收。前体药物在体内通过酶解或水解等作用转化为原药而发挥疗效 (陆彬 ， 2005)。 备成环糊精包合物 制备成环糊精包 合物就是将难溶性药物分子被包合于环糊精 (环糊精衍生物分子空腔中。由于药物分子具有很高的分散度，同时由于环糊精的亲水性，使包合物具有良好的可润湿性，因此 增大了 药物 的溶解度 ， 改善了 其体外溶出特性和人体生物利用度。 备成固体分散体 制备成固体分散体就是采用适当工艺技术 将 难溶性药物与适宜载体形成的固体分散体。由于药物以微晶态，无定型态、胶体分散态或分子分散态存在，具有很大的分散度，当与胃肠液接触后，药物的溶出速度加快，可促进药物的吸收，提高生物利用度。制备固体分散体常选 用亲水性或两亲性载体材料，以不同载体材料制成的固体分散体对药物溶出的影响不同，如以 载体，随着 量增加，药物的溶出速率增加， 子量的增加可提高药物的吸收量，但药物的吸收速率不受影响。以磷脂为载体制备的固体分散体可提高药物的峰浓度，缩短达峰时间，但曲线下面积无显著差异，增加载体的用量，药物的溶出速率并不随之增大。制备固体分散体的关键在于形成并保持药物的高度分散状态，一般采用熔融法和溶剂法。 增加药物溶解度和生物利用度的方法很多， 在此 我们将重点介绍环糊精包合技术与应用。 皮素的理化性质 及溶解度和稳定性的探讨 柚皮素易 溶于 甲醇，溶于 乙醇、乙醚和苯 等非极性有机溶剂 ，几乎不溶于水 ，同时 在空气和溶液中 极易被氧化， 性质很不稳定。因此， 虽然柚皮素具有多种药理活性，但它的理化性质却 降低了药物的生物利用度， 限制了 药效的发挥 。 通过对柚皮素的剂型 进行 研究，找出 行之有效的 能够改善其溶解度和 提高 稳定性的新 方法变得较为迫切 。 兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 5 糊精概述 1891 年意大利科学家沙丁格发现 了 环糊精（ ，并由他的名字命名为沙丁格糊精（ 20 年 后世界第一例环糊精包合物问世。 1959 年 择结合及催化一些有机反应的性质，并明确提出了可以借助分子间作用力制备包合物，以改变化合物的物理化学至性质 (童林荟， 2001)。由于环糊精本身并无毒副作用，可以在医药、食品、化妆品等方面作为辅料广为应用，这些工业应用极大地促进了环糊精化学的发展。使用环糊精进行包合的药物在提高药物生物利用度、溶解度、溶出速度等方面显示出了其独特的性质，使得科学家们投入大量精力进行研究 。 经被中国、美国、日本及欧洲等国 作为口服辅料纳为他们药典的一员。比如，前列腺素 合物开发制作的新剂型也已在日本和欧洲发售，上市后的口碑不同凡响 （ 1999） 。此外，美国药学会 载了多种 生物， 批准 为药用辅料上市，欧洲药典也将 录。 糊精作为新型药用辅料的优势 环糊精作为药物的新型辅料，可以有效 地 改进药剂处方。在药学中的应用，随着不同用途的环糊精衍生物问世，目 前 在 缓释制剂、控释制剂、靶向制剂、透皮吸收制剂、黏膜吸收制剂等新型给药系统的不断开发中，环糊精的应用研究也不断地扩大和深入。环糊精的优势主要集中于：提高药物稳定性；增加药物溶出度，提高生物利用度；使液体药物粉末化、防止药物挥发；掩盖药物的不良气味、降低刺激性；调节药物的释药速率；促进药物经皮肤和黏膜吸收等。在新制剂技术及新型给药系统的开发中，深入研究环糊精具有非常可观的市场应用价值 (朱盛山， 2003)。 糊精的空间结构 环糊精结构是一个 筒状结构的 多糖， 是淀粉经酶解环合后得到的 612 个葡 萄糖分子连接而成的环状低聚化合物 (1998)。 环糊精有一个疏水的中心结构以及外部的亲水表面，可以将客分子封装至中心结构 ，从而 提高药物的溶解度 (1999; 2006)。 糊精的分类 环糊精常见的结构主要是 、 、 三种亚型，分 别是由 6、 7、 8 个葡萄糖分子，通过 苷键连接而成的环状化合物，对于绝大多数药物来说， 内径稍小； 然腔内径较大，可用于包合很兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 6 多药物，但价格昂贵； 洞大小适中更适合于包合药物， 考虑到环糊精分子内的洞穴直径大小以及成本等因素 (1996)， 药物制剂有比较重要的实际应用价值 (2002; 代国飞 ， 2005)。葡萄糖分子上的 6 位羟基最有活性， 3 位上的羟基最稳 定 。但是，环糊精上的羟基活性差别不是很大，这主要取决于反应条件（温度、碱度）。所以进行专一性强、选择性强的环糊精衍生物制备并不容易。 由于工业上制备的环糊精纯度很低，要生产高纯度的环糊精代价巨大，所以环糊精的应用一直以来仍 受到限制。 糊精的水溶性 中溶解度较低。室温下每 100能溶解大约 14g 23g 只能溶解 是因为 环状结构最致密，更易结晶。 合水溶性差的药物后溶解度可以增加数倍，但也不过使药物浓度达到 00就是 一个原因是 静脉注射途径人体给药后，不能被人体代谢，在肾脏中以不溶性胆固醇的复合物晶体形式存在，从而导致非常严重的肾脏损伤；有些 萃取 ”红细胞膜上的成分， 如磷脂、胆固醇和蛋白质，从而造成膜的破裂和细胞内重要物质的丢失，产生溶血作用 (2002;)。其中，随机甲基 被认为是不适用于注射途径的辅料 (2002; 1999)。所以非常有必要对 行化学修饰或者结构改造，提高其的溶解度、防止不溶性胆固醇的复合物晶体的形成而且还要密切关注其溶血性。 第一个用于制剂的环糊精衍生物是高水溶性的（ 2,6现在来看并不是一个很好的衍生物，但在当 时却是对许多疏水性药物最为有效的增溶剂。这种衍生物表面活性高，对胆固醇有较高的亲和力，即使 1mg/浓度也引起人体红细胞的溶血。另外一个问题，其制备复杂、价格比较高昂。随机甲基化的 已经工业化生产，完全可以替代 生物 (2002)。 第二类是用于非胃肠道途径给药的 生物，这其中以二羟丙基环糊精衍生物为代表，它通过环糊精在碱性水溶液中与 31,2称 “表氯醇 ”）反应制得。比如，含有羧甲基或二乙氨乙基的二羟丙基的离子基团的环糊精衍生 物，可作为酸碱性药物的优良增溶剂。此类衍生物没有表面活性与溶血性。因为其中含有一定量的平均分子量在30008000 道尔顿的高水溶性的环糊精低聚物。 这些衍生物可以用于口服或外用的制剂处方中，但目前还没有作为非胃肠道给药载体而进行详细的研究 (1998)。 第三类 生物以纯度较好但分子量分布窄的羟烷基衍生物为代表，如羟乙基、兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 7 2类衍生物表面活性可以忽略不计，而且溶血性大大降低。毒理学研究进一步表明其中至少有一种衍生物 ， 2 22非胃肠道给药途径即使在很高剂量下人体也具有很好的耐受性 。2国外已获得了批准上市，且含有 2药物注射制剂也已经投放市场。2有良好的增溶能力，可以解决一些难溶性药物的溶解度低的问题，但其对药物的增溶能力还不能达到令人十分满意的地步， 例如 在具体应用中还要使 用更高的剂量，或者被增溶的药物形成溶液后稳定性不太理想 (1999)。 另一类环糊精衍生物就是本课题中采用的磺丁基醚 ，其为羧烷基醚类衍生物，具有广阔的应用前景， 非均一的环糊精衍生物，表现为无定型或非结晶状态，羧烷基直接与环糊精中的葡萄糖环相连，或者通过醚键与环糊精中的羟烷基侧链相连。研究表明，环糊精环上随着取代基的增多，其洞穴的包容能力也相应地减弱，所以低取代的衍生物更具有优势；但另一方面环糊精环上取代程度增大，其溶解度变大，且离子基团的取代能降低溶血作用，可以与不同的离子型客分子反应，增加了包合物的稳定性和溶解度。将离子 型基团引入环糊精环上，不仅可以成盐、增大溶解度，而且还具有一些新的药理活性。目前烷基化 烷基化 们在稳定性、低毒性、水溶性好等方面前景可观 (2002; 2004)。 概述 背景介绍 无毒、安全等优点，在科研生产上被越来越多地使用。 1,4对 、 3、 6 位羟基进行取代合成，可以获得 2 所示 (2002)。 兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 8 图 2 磺丁基醚的化学结构式 of 外观是白色或偏白色的无定型粉末，在水中的溶解度可以高达 500g/L，30%的水溶液 为 其相对分子质量 （ 与取代度 （ 关系为 ： 取代度为 4 的 704） 和取代度为 7 的 241） ， 商品 名 1990 年由美国 司开发 (古福根 , 2004)。其中， 聚物的形式是 (种多聚物是阴离子 型的 、水溶性 较 高的环糊精衍生物 。 它们 可以 与药物分子进行包合形成非共价复合物， 从而 提高药物的水溶性、稳定性、安全性、降低其挥发性 、 肾毒性、控制药物释放速率并且掩盖药物不良气味 (2004; 2001)。前主要被 用 于 一种新型 抗癌药物 的 眼部药物传递 系统 (2001)。 药物 的增溶作用 药物与 行物理作用，不但 可以 提高药物在水中的溶解度、生物利用度，并且 包合 后环糊精可以缓控释地把药物传递到目标位置， 释放药物 。这 种 制剂可以有效地降低药物对目标位置的刺激性、增加药物的稳定性、掩盖药物的异味 (1996)。在大鼠实验中，静脉注射甲泼尼松 合物，生物利用度有效地高于未包合的药物（甲强龙磷酸酯，甲强龙半琥珀酸酯） (2001)。增溶桂利嗪， 1995)。 行包合制成口服片，给小狗喂食后检测达那唑的生物利用度（ 在体内发现达那唑的绝对生物利用度可以达到 64%， 使原有 药物的生物利用度提高了 33 倍 (2002)。 制备了青蒿素（ 合物，利用相溶解度法研究其包合比例，并通过热重分析、末衍射和扫描电镜检查法进行初步表征 ， 结果表明 ,蒿甲醚可以有效地封装在环糊精空腔里。水溶液含有大量的包合物，其可溶性明显高于游离青蒿素 (2012)。苯妥英（ 水溶性很差，储存时会以沉淀形式析出，影响其药理作用。 合物和 合物来提高原药的生物利用度和溶解度。 别与 成 1:1 包合比的包合物，药物动力学研究表明，包合物的生物利用度 （ 4h） 提高了两倍 (1998)。地匹福林 （ 临床上用 于治疗高眼压症及慢性开角型青光眼，其水溶性及稳定性都很差。 人研究了 ， 3770 环境下环糊精的浓度对药物稳定性的影响。结果表明，带负电荷的 中性的 比能很好地与正电荷的 成稳定的包合物并且显著地提高了 液的稳定性。 37 、 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 9 时， 液的稳定性较提高了 100 倍，而 合物只提高了 5 倍 (1997)。 将 多西紫杉醇使用 行包合，增加了它的口服生 物利用度和水中的溶解度 (2012)。 目前常见蛋白质类激素和多肽，也可采用环糊精及其衍生物进行包合 (张奕 , 1999)。近期研究结果表明， 为一种新型的药用辅料，具有其它环糊精类衍生物无法比拟的优点，其负电荷支链对正电荷的含氮药物有特殊的包埋性与亲和力，能更好的增加药物的稳定性及溶解度，改善药物的释放速度，提高药物的生物利用度，减少药物的挥发性和药物对局部组织的刺激性，降低毒副作用。虽然 经有了很好的药物应用，但也存在着增加了某些药物的稳定性和溶解度的同时 ，出现 降低药 效的缺点。所以，今后研究中如何克服这些缺陷，不同药物与不同取代度的 包合作用对药效的影响及药物剂型应用的关系，以及不同 件对包合作用的影响 需要 进一步的研究 加以 探讨。 属配合物的背景介绍 过量的致癌因子在体内由于自由基的富集，使脂质细胞的脂质发生过氧化反应，导致细胞的 链断裂，引起癌变 (曹志权 ， 1993)。 科学家们受到金属配合物的启发， 通过对 天然药物的有效成分与微量元素 的 深入研究 ，发现药物的活性成分其实是无机与有机成分的协同作用 ，由此建立了 天然药物配位化 学理论。 属配合物配位研究 1870 年，苏黎士大学 表了系列学说 “对于亲和势与价理论的贡献”、“对于无机化合物结构贡献”，并首次阐释了配位化合物、配位数及现代配位键的概念。配位化学学说 (朱旭祥 ， 1997)认为， 单一的有机成分与微量元素都不是天然药物的有效成分，只有当有机成分与微量元素结合而成的配位化合物后，这种新型结构更能体现中药物质基础，并代表中药的活性作用核心。中药配位化学学说指出，中药的有效成分不仅是配合物的形式，而且以配合物形式在人体内产生作用。我们所了解的中药有效成分之间协 同或拮抗作用的本质，是有效成分的结构形态或者存在状态，由配位反应发生改变，从而改变了生物活性。 微量元素在配合物中发挥了重要的药理活性及作用。人体中最丰富的微量元素就是铁，它是肌红蛋白和血红蛋白的组成成分，参与体内氧的运输储存并维持生物体的正常生长发育和免疫；锌影响着人体的免疫功能，它在生物体中发挥着清除自由基的功能，它还参与组成铜锌 超氧化物歧化酶 （ 州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 10 是一类能够有效清除超氧阴离子（ 由基的极其重要的抗氧化酶 (2008; 2005)。金属酶的辅助因子最常接触到的是铜，它参与了人体的免疫反应过程，并有效地增强机体防御功能，属于一种必不可少的微量元素 (高宏科 , 1993)。铜在机体中参与到抗氧化反应，比如铜蓝蛋白中含有的血清铜作为细胞外液的一种抗氧剂 (2008)。张振学等研究发现，芦丁对癌细胞并没有杀伤力， 溶液对癌细胞具有轻微杀伤力，但芦丁 合物的杀伤力却很强 (张振学 ， 1996)。张企兰等比较了十余种抗癌中药中硒的含量，文章指出具有抗癌活性的 中药中硒含量明显高于其他药物，说明微量元素硒与抗癌活性密切相关 (张企兰 ， 1995)。舒荣华等观察到黄芩苷 非特异性免疫、红细胞免疫系统有很强的影响，结果表明，配合物的药效强于原药 (舒荣华 ， 1989)。 酮类金属配合物研究现状 黄酮类化合物是一类含有多酚类植物成分的群体，以游离态形式或者与糖结合成苷的形式存在，对我们日常饮食生活有着很大的作用。 它们拥有多种的生物活性及药理活性，例如抗病毒、抗氧化、抗炎、抗过敏、治疗肝损伤以及抗肿瘤活性等我们所熟知的生理活性 (2010)。其配 合物的研究成为了近年来无机生物方向的热点，在研究金属离子与药物配体的合成、结构及相互作用后，深入研究配合物的药理生理活性以及构造、稳定性、作用机理等方面有非常重要的作用。 人 研究了金属配合物与 相互作用，并开发了桑色素的铜配合物 (2阐述了桑色素与配合物结合 机理， 发现它们与 结合模式不同：配合物对 嵌入结合，而桑色素对 非嵌入结合 (2002)。究了杨梅酮变异的脱氧核糖分解体系， 而且比较了三价铁离子与助氧剂条件下的抗氧化能力： C)； 究中发现杨梅酮本身具有微弱的抗氧化性，但是与铁离子螯合之后具有超强的抗氧化性 (2011)。微量元素钴刺激机体生成促红细胞生成素，加速胃肠道里铁的吸收并善于储存铁，使铁离子进入骨髓中被利用 (2008)。韩苹果初次使用柚皮素与金属钴进行配位，初步合成并且柚皮素 系列的表征 (韩果萍 ， 2011)。 行了 槲皮素的投料及反应过程对槲皮素 合物稳定性的试验研究(2005)。 柚皮素的化学结构为 4,5,7众多的生理活性，主要的活性 有 抗氧化性 ，如 清除活性氧（ 抑制单胺氧化酶生成 等 (2009)； 还可以有效地预防或治疗癌症 (2008)。 很多植物中富含柚皮素和柚皮苷(2005)， 柚皮素具有众所周知的阻抗自由基及抗氧化的作用，抑制了脂质的过氧兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 11 化，破坏了随之产生的癌细胞来完成抗癌过程。在自然界中， 柚皮素作为有效的抗氧化剂，经常合成新的抗氧化剂来提高自身的 抗氧化能力（ (1994)。 前人研究基础之上合成了柚皮素 种配合物可以有效地清除活性氧、 基、超氧阴离子自由基，并且清除能力都强于原药 (2012)。贾冬英等研究了二苯代苦味肼自由基法（ 硫代巴比妥酸法（ 三种柚皮苷 果表明，这三种配合物均能清除 由基（柚皮苷 合物 柚皮苷 合物 柚皮苷 合物）。其中，柚皮苷 合物的抗氧化活性显著高于阳性对照组抗坏血酸 (贾冬英 ， 2005)。 上述研究表明，中药活性成分与 金属离子形成配合物后，有利于增强药物的生理活性。将柚皮素与金属离子制备成配合物，有望提高其抗氧化活性及生物活性。 丽隐杆线虫的背景介绍 秀丽隐杆 线虫 （ C. 作为分子生物学、遗传生物学以及基因组学研究的模式生物被广泛使用。其归属于线形动物门、胞管肾纲，为一种多细胞真核生物，在土壤中能自由生长，以大肠杆菌为食，遍布于世界的各个角落。小体型，简单生长环境，使得 C. 适宜的温度、氧气、湿度下容易生长繁殖，所以在实验条件下容易培养、繁殖和保存 ,这种特殊的优势是鼠类、兔类或者果蝇等模式生物不易具备(1997)。 理特征 C. 型很小，成虫只有 。目前，在基因组中它是最小并已经完全测序的多细胞真核生物，整体是由表皮、食管、导管、咽道、生殖与排泄系统构成，它的基因 组均匀地分布在六条染色体上，具有基因密度高与内含子少的特性。如 图 3 所示。 兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 12 图 3 秀丽隐杆线虫的解剖图 （引自丁晓霞， 2009） 从图中我们可以观察到 C. 位于身体最前端，雄性的泄殖系统和雌雄同体的肛门都 靠近身体的后侧腹部。其全身呈透明状，使用显微镜 可以 很清晰地观察到由咽道和肠部瓣膜所组成的肠道系统。通过咽部肌肉产生收缩刺激线虫进食，在底部的球形咀嚼器粉碎食物细菌，然后把食物细菌通过咽部和肠部瓣膜送入肠道再进行消化，通过显微镜观察 C. 食是其咀嚼器的收缩进行的。简单结构只有 20 个细胞，组成肠道结构(2003)。 体壁肌肉单细胞均匀地分布排列在 C. 整个背部和腹部，并位于皮下组织下层，形成了 4 条树状的菱形带子，每条带子大约有 2 个细胞的宽并且是由 24 个肌细胞组成 ，但是左腹的带子则是由 23 个肌细胞组成，这些肌细胞的作用是外界刺激传递到神经细胞上并通过肌肉神经突触完成这一过程。 C. 动很简单，是由腹肌和对应的背肌调节收缩完成的。复杂的身体活动需要对应的部位进行高级协调，比如进食、雄性线虫交配等运动 (2003)。 C. 雄性 （ 和雌雄同体 (分，通过显微镜的观察发现雄性较雌雄同体更加瘦小，见 图 4。雄性只可以产生精子，必须与雌雄同体的卵子进行受精，而雌雄同体可以自我繁衍。所以实验室中研究利 用的为雌雄同体的 C. 兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 13 图 4 雌雄同体与雄性秀丽隐杆线虫的形态 （引自丁晓霞， 2009） of 雄同体 C. 感觉细胞位于线虫的头部，神经细胞富集于咽部神经环、腹部神经链及尾部，总数达 302 个。神经系统的功能主要是应答对外界刺激环境和调节并控制线虫的行为活动，使线虫可以感受到外界的各种刺激。雄性比雌雄同体线 虫多 79 个神经细胞，这两种性别的线虫的神经系统主要区别在它们不同的性行为上。从连续的电子显微照片清除的看出，线虫的复原由神经系统的连接性决定了，正是具有这种单纯而独特的神经系统，所以将它被作为模式生物 (2003)。 C. 胚胎发育之后会随着性别的区别逐渐体现出生殖部排列及尾部的不同，但它们都具有简单管状结构的生殖部并进行着生殖细胞的细胞核分裂过程的复制，在生殖口处胚胎细胞逐步成熟。特别指出的一点是，线虫精子是类变形虫，不具有其他生物的鞭毛结构 (2003)。雄性线虫 的生殖部与排泄腔相连，在尾部管状处闭合，雌雄同体线虫由前后对称的部分组成，这一前一后在线虫的中部回转并在中腹部形成生殖口处的子宫，并通过在此处的肌肉细胞的作用下进行产卵，在输卵管和子宫间的精囊中完成受精。所以雄性和雌雄同体的区别在于雌雄同体的尾部结构较为复杂，包括与交配相关的复杂肌肉及神经系统。除此之外，线虫体壁内还有排泄腺、孔、管和排泄细胞组成的分泌系统，还有体腔的区别，雄性有 5 个，雌雄同体有 5 个，具体的功能还有待开发，目前尚不清楚(2003)。 长发育周期 在实验室条件下，线虫可 以很快完成生长发育。研究发现线虫在 15 时，从受精卵到可以进行繁殖需 6 天左右，在 20 时这个过程大概需要 4 天时间， 25 时这个过程不及 3兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 14 天。在 20 时，线虫繁殖速度最快，一条未产卵的成虫在 4 天的时间里大约可以产卵多达300 个 (2004)。在实验室的培养皿上放置几条线虫，几天后就能得到大量的线虫后代。 C. 生长发育由胚胎期、幼虫期以及成虫期构成。第一个过程胚胎期是由受精卵孵化并发育成 的线虫，在这个时期内线虫体型很瘦小，长度大约只有 250m 左右，结构与成虫相似。胚胎的发育后期 包括了 个幼虫期，最后一期的线虫蜕皮后为成虫。在 20 条件下， 14 个小时左右卵开始进行孵化，在开始的几个小时内在雌雄同体线虫的子宫内进行，卵化的线虫分在随后的 29、 38、 47 和 59 个小时内连续蜕皮，只到发育成虫。由此可以看出 C. 胚胎发育过程是连续进行的。当线虫处于食物缺乏和高密度竞争等不良外界环境下，在第二次蜕皮即 后停止进入 ，而是进入了一个特殊时期 ，这个时期是线虫为了抵御外界不良环境继续生存的一种特殊手段。 C. 受精卵发育到可 以进行产卵大约需要 3 天时间 (1997)。 丽隐杆线虫与黄酮类药物的研究进展 黄酮类化合物作为次生植物复合物的主要亚群，它随着结构和空间上的改变有着不可比拟的生物多样性 (2004)。它的广泛生物化学功能归因于其多酚类结构，而且这种多酚类结构同生物活体的健康与衰老密切相关，结构见图 5。 图 5 黄酮化合物的化学结构 . of 过模式生物可以得到众多信息，例如，黄酮类化合物中的槲皮素 或儿茶酚在小鼠动物实验中已经显示出了延长寿命的功效 (2008; 2008; 2009; 2009)，但是高温 (2009; 2007; 2009)或氧化应激反应 (2007; 2009; 2009)对动物会 产生不利的影响。 黄酮类化合物在酵母中 可以提体现 延长寿命和应激反应 的优势 ， 但是通过 黑腹果蝇和小鼠的研究 中未出现，这也 表明 了不同物种之间 的进化是保守的 (2011; 2007)，在这些进化中可能会影响到生长的轨迹，尤其是经常提到关于它们高抗氧化活性的特质 (2009; 1998)。在体外测兰州大学硕士学位毕业论文 柚皮素包合物、金属配合物的制备及生物活性研究 15 试中，构效关系决定总抗氧化能力 （ 、三价铁离子的还原能力 （ 的抗氧化能力 (2005)。在邻苯二酚结构中， B 环 （ 3,4、羟基 （ 3和 C 环上双键的已经证明了是产生高抗氧化作用的重要先决条件 (1995; 2002)。 C. 一种重要的 模式生物，结构简单、身体透明、易于观察、繁殖周期短等生物学特征赋予了其成为模式生物的前提。 曾采用 C. 油茶籽饼中提取的多聚糖进行了考察，证明了多聚糖可以产生抗氧化和抗肿瘤活性 (2012)。 利用 C. 验研 究肌肉蛋白 型的模拟修复，发现它是肌肉细胞结构和钙离子释放的最佳影响方式 (2012)。 过对四种黄酮类化合物的比较发现黄酮类化合物的酚羟基数目可以影响 C. 寿命，酚羟基数目 与线虫寿命成正比。 C. 型可以用于黄酮类化合物抗氧化及 延寿 等生物活性方面的评价 (2012)。 提出 化学结构为 4， 5， 7是黄酮类化合物中一个具有代表性的药物，具有 抗 氧化性、有效地清除 制单胺氧化酶生成，有效地预防或治疗癌症等 多种 活性。 溶于甲醇，溶于乙醇、乙醚和苯等非极性有机溶剂，几乎不溶于水，同时极易被氧化， 因此尽管 有多 种药理活性，但 溶解度差和不稳定等 理化性质却 影响了柚皮素的生物利用度及临床应用 （郭国超， 2010） 。 一种 阴离子型高水溶性环糊精衍生物 ，通过与难溶性性药物形成包合物可有效提高药物的溶解度和稳定性。与 比具有毒性低、 高水溶性、缓和药物溶血性 的优点，常被应用于片剂、注射剂等制剂，是一种发展潜力很大的新型药用辅料。将难溶性 备成 合物，国内外未见报道，有望提高 溶解度、稳定性以及生物利用度，拓展 临床应用。 金属配合物可以使 药物与金属离子产生协同 作用， 可以 提高某一成分的活性 ，具有 提高药效的潜能。黄酮类化合物的铜、铁、锌金属配合物已显示出较好的清除自由 基和抗氧化能力。尽管已有文献报道柚皮素金属配合物，具有清除自由基的功能，但是生物体内试验仍未见报道。因此，本课题拟进行： 制备 合物，通过相平衡试验阐述了包合物的形成机理，采用正交试验设计优化了包合物的制备工艺。同时，为提高 药效和生物利用度，本文自制了 种金属配合物。 本文