微生物遗传育种论文.doc

工业微生物诱变育种技术及其应用刘世双（山东农业大学）摘 要 诱变育种是目前国内外最常用的工业微生物育种技术。本文综述了几种普遍和新型的物理和化学诱变育种技术及其机理和应用状况，并对这些育种技术存在的问题进行分析，提出了解决问题的有关建议。通过对当今分子生物学技术的飞速发展和应用的分析，对未来利用基因重组和基因工程等技术进行微生物定向诱变育种进行了展望。关键词 微生物;诱变育种;机制Mutation Breeding Techonologyand Its Application of Industrial MicroorganismLIU Shishuang(Shandong Agricultural University)Abstract mutition breeding is the most common breeding techonology of industrial microorganism at home and abroad untill now. this article generalize several commonly and newly physical and chemical breeding techonology and analyse some major problems,proposing related suggestions.through the analysis of the rapid development of molecular biology and its application,I give my hopes to the application recombinant DNA technology and genetic engineering in microbial-directed mutagenesis breeding.Key words microorganism；mutition breeding；mechanism工业微生物能产生人类生产生活必不可少的药物、食品、化工产品等生物制剂，具有极大的市场潜力和社会价值。因此，选育具有优良性能的生产菌株已成为当今的研究热点。目前最常用的工业菌种选育方法主要有自然选育和诱变育种。由于自然选育的几率特别低，一般为10-610-10，相比而言诱变育种技术能大幅度提高突变效率并且简便易行，对设备和工艺条件的要求也比较低，所以诱变育种技术应用最为广泛并取得了良好的效果，例如青霉素生产茵的产量在40年内就增加了300多倍，达到60008900 UmL 1。一 常用诱变育种技术和应用现状微生物的诱变育种，是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以提供科学实验或生产实践使用2。1.1 物理诱变1.11 紫外线(UV)紫外线是非电离性质的射线，能作为能量被物质吸收。由于DNA和RNA的嘌呤和嘧啶的最大吸收峰为260nm，故工业上常用功率为15W波长260nm的紫外灯处理距离固定在30 cm左右的菌（孢子）悬浮液。紫外线诱导突变的机制有多种解释，其中最常用的是使DNA分子形成嘧啶二聚体。双链之间的嘧啶二聚体会阻碍双联的分开和复制；而同一链上二聚体的形成会影响碱基的正常配对，在复制时这一点会停止或错误进行，从而改变了碱基序列，引起基因突变3。紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到,因而被广泛应用。例如国外Walid A Lotfy等用紫外线柠檬酸产生菌Aspergillusniger UMIP2564获得成品收率达到6025的变异菌株W4。此外，酵母菌株的诱变大多采用紫外诱变的方法。1.1.2 激光激光是一种光量子流，激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合应用，直接或间接地影响有机体，引起细胞染色体畸变效应、酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变5。主要机制是使细胞内DNA分子吸收积聚能量并进行能量再分配，使细胞内DNA处于一种易突变的状态，继而发生一系列诸如断裂、聚合、交联等物理变化和化学变化，导致DNA的损伤和突变，最终引起了突变株的产生。目前，激光诱变微生物技术仍然停留在实验室阶段，尚未投入生产实践，其中最重要的一个因素是微生物变异菌株的遗传稳定性问题。有文献称激光诱变稳定性只保持在4、5代之内，但是也有文献报道有些微生物在10代以上也比较稳定。如有人利用He-Ne诱变亚麻酸产生菌少根根霉，所得高产菌株经传代10次以后仍具有良好的遗传稳定性6。1.1.3 电离辐射X射线和-射线、B一射线和快中子等都属于电离辐射。其中-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量。电离作用的机理是与原子或分子碰撞时把全部或部分能量传给原子产生次生电子，次生电子产生电离作用，从而直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者断裂脱氧核糖与碱基之间的糖苷键、脱氧核糖和磷酸相连接的磷酸二酯键。其间接效应是使水或有机分子产生自由基,这些自由基与细胞中的溶质分子起作用,发生化学变化,作用于DNA分子而引起缺失和损伤。此外,电离辐射还能引起染色体畸变,发生染色体断裂,形成染色体结构的缺失、易位和倒位等，从而改变微生物的遗传性状3。但是电离辐射有一定的局限，原因是操作要求较高，且有一定的危险性，通常只用于不能使用其他诱变剂的诱变育种过程。11.4 微波微波辐射属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围在300 MHz300 GHz，对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升，从而引起生理生化反应；非热效应指在微波作用下，生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应7。微波能刺激水、蛋白质、核酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动，这种震动能引起摩擦，能够对氢键、疏水键和范德华力产生作用，因此可以使得单孢子悬液内DNA分子间强烈摩擦，孢内DNA分子氢键和碱基堆积化学力受损，使得DNA结构发生变化，从而发生遗传变异8 。作为一种新型的诱变育种技术，对微波的研究及应用还很少，也很不系统。但是，微生物诱变育种却具有许多优点,如基因组小、世代周期短和易于培养分离等9。这些优点决定了微波在微生物育种方面的应用研究必须得到重视。因此，微波诱变作为一种新兴的微生物育种技术将具有不可估量的潜力。1.1.5 离子束离子束作为一种新的诱变技术虽然在微生物上的应用起步较晚，但成果显著。诱变机理是利用离子注入设备产生高能离子束(4060keV)注人生物体，并与生物体内物质发生化学或物理变化，逐渐使能量传递到生物体内，从而引起遗传物质的永久改变。离子注入对噬菌体的影响迄今为止还停留在理论研究阶段，没有应用的实例报道，但是实践已证明离子注入技术适用于多种微生物。由于离子注入射程具有可控性，随着微束技术和精确定位技术的发展，定位诱变将成为可能10。这说明离子注入诱变育种技术必将有极大的发展潜力。1.1.6 空间诱变技术空间诱变技术是一种将航空航天高科技技术与生物诱变技术结合的新型诱变技术，是利用宇宙空间特殊的环境让微生物产生变异。特殊的空间环境条件主要包括强宇宙射线，高真空和微重力。在探查微重力环境对辐射诱导遗传物质损伤的影响方面,国外做了大量的宏观和微观研究。Pross等提出了一个空间试验的设计方案,分析微重力环境对辐射DNA链断裂修复的影响,发现微生物在空间条件下,兼有它的稳定性和变异性;微重力环境可能干扰DNA损伤修复系统的正常动作,即阻延或抑制DNA链断裂的修复11。自1987年以来,我国空间科学家和农业生物学专家9次利用返回式卫星、2次利用神舟号飞船和4次利用高空气球搭载了70 多种植物近50kg的种子,涉及粮、棉、油、蔬菜、瓜果、牧草和花卉等植物。已经培育出19个新品种，还培育出50多个新品系和许多优良菌株及一批优质种质资源12。利用空间特殊的环境条件对微生物进行搭载诱变,能取到普通诱变育种所不能达到的效果，能培育出高性能的优良菌株，所以空间诱变育种技术将具有广阔的应用前景。1.2 化学诱变1.2.1 烷化剂烷化剂具有活性烷基，能取代DNA分子中活泼的氢原子，从而改变DNA的分子结构，致使在复制的时候会使配对发生错误，引起菌株的变异。碱基最容易对嘌呤的N7位点烷化导致突变，具体可分为烷化嘌呤，脱嘌呤和鸟嘌呤的交联作用。当前应用最为广泛的烷化剂是甲基磺酸乙酯（EMS)，诱变率很高，它诱导的大多是点突变。其次是超诱变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和硫酸二乙酯(DMs)，但由于大多数烷化剂毒性太强，操作要求很高，目前很少使用。1.2.2 碱基类似物碱基类似物分子结构类似天然碱基，可以掺入到DNA分子中导致DNA复制时产生错配，mRNA转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变5。该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。常用的碱基类似物主要有5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、6-氯嘌呤等。1.2.3 移码突变剂移码突变剂是一类能插入到DNA分子中间使基因发生移码突变的化学试剂。移码突变剂已知的作用机制是插入到DNA双螺旋的碱基对之间，使DNA链拉长，2个碱基间距离拉宽，从而造成DNA链上碱基的添加或缺失，所以可能会造成碱基突变点之后的全部遗传密码转录和翻译错误，引起菌种性状的变异。目前最常用的移码突变剂是吖啶类染料和溴化乙锭。但因其对人体的致畸致癌作用，实际应用中也受到一定的限制二 常用诱变技术存在的问题和解决方案目前，国内微生物育种界主要采用的仍是这些常规的物理及化学因子等诱变方法。虽然现在这些技术取得了很大的进展，但是这些常规的诱导方法存在一定的不足。已知诱变育种的基本环节可分为:出发菌株（诱变）少数存活（筛选）少数突变（筛选）少数正变(筛选) 少数幅度大（筛选）少数适宜投产（筛选）。可见通过随机诱变的育种技术虽然简便易行但是存在一定的盲目性且筛选效率很低。因此必须采取可行的方案提高诱变的综合性能。对于常规诱变育种可采用以下几个方面来提高诱变育种的效率：2.1 选择简便有效的诱变剂2.2 选择最适量的诱变剂2.3 挑选优良的出发菌；2.4 尽量处理单细胞和单孢子悬液2.5 采用复合诱变的方法2.6 设计高效筛选方案2三 诱变育种技术的未来研究方向和展望随着现代细胞生物学和分子生物学的飞速发展,在国内外已普遍开始研究重组DNA和原生质体融合相关的育种技术应用，不过用于工业菌种大规模生产的还不多，但是基因水平的诱变研究大大提高了育种的突变率并使育种技术有了明确的方向性。今后在以下几个方面将具有极大的研究价值：3.1 生物诱变技术 是点突变技术在蛋白质工程中的广泛应用, 可以引起碱基的取代和断裂，产生DNA的缺失、重复和插入等突变4。基因诱变剂可以是特定噬菌体，如M13DNA介导的1段寡核苷酸；也可以是细菌质粒DNA ,如PCR介导中作为引物的l段寡核苷酸；也可以是DNA转座子。3.2 基因改组技术 是在传统诱变基础上，通过细胞融合技术，对诱变后的微生物细胞进行基因组重组，从而使具有正向突变的茵株将其优点结合在一起，进而提高微生物细胞的正向突变频率及正向突变速度13。3.3 基因重组育种 最具代表性的是原生质体融合技术。原生质体融合技术不受亲缘关系的影响，所以能进行原生质体融合的细胞极其广泛，并且重组频率极高。3.4 基因工程育种 它是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达1。与前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。参考文献：1 房耀维，范琳，牛艳芳等.工业微生物育种技术研究进展J.洛阳师范学院学报,2002,(2):95-99.2 周德庆.微生物学教程M.北京：高等教育出版社，2002.3 诸葛健.微生物遗传育种学M.北京:化学工业出版社,2009.4 李荣杰.微生物诱变育种方法研究进展J.河北农业科学, 2009,13(10):7376,78.5 韩丽丽，刘敏.诱变方法在微生物育种中的应用J.酿酒，2008,35（3）：16-18.6 陈云琳，刘晓娟，闻建平.激光诱变微生物技术的研究进展J.生物物理学报，2003,19（4）：353-358.7 陈义光.新型物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用进展J. 长江大学学报,2005,02(5):46-48.8 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