【毕业学位论文】（Word原稿）番木瓜离体快繁体系的建立-果树学

I 分类号 学校代码 10564 学 号 2004216006 密 级 学 位 论 文 番木瓜离体快繁体系的建立 指导教师姓名 李建 国 研究员 申请学位级别 硕 士 专业名称 果树 学 论文提交日期 2007 年 5 月 论文答辩日期 2007 年 6 月 2 日 学院名称 园艺 学院 学位授予日期 2007 年 6 月 答辩委员会主席 林顺权 教授 评阅人 易干军 研究员 黄旭明 教授 摘 要 研究以番木瓜（ .）为试材，比较系统地摸索了影响离体再生的多种因素，建立了番木瓜组织培养高效离体快繁体系，并在此基础上，对目前番木瓜快繁中存在的主要问题（根系质量差）进行了初步探讨，以番木瓜组培生根苗正常根系与膨化根系为材料，开展了番木瓜细胞组织学、形态学的观察与分析，取得的主要结 果如下： （ 1）无菌培养体系的建立阶段，采用番木瓜 顶芽与侧芽为外植体诱导丛芽，外植体采用的消毒方法为：自来水冲洗 10 饱和肥皂水浸泡 20 无菌水冲洗3 次 75 酒精 30s 无菌水冲洗 3 次 4 无菌水冲洗 4 次 接种至含有 “山农一号 ”I 型溶液的培养基中。诱导培养基为： 30g/L 蔗糖 琼脂。 （ 2）不定芽增殖阶段，采用 3/2+蔗糖 30g/L+琼脂 的配方为培养基，增殖系数 株高度理想，生长健壮。 （ 3）不定芽诱导生根阶段，采用两步生根法。第一步根系诱导阶段采用正交设计优化出的配方 蔗糖 30g/L+琼脂 为基本培养基，第二步根系生长阶段采用 白培养基并附加 活性炭。台农一号可达到80以上的平均生根率，且生根根系质量得到改善，细长，无愈伤。 （ 4）移栽阶段使用基质为泥炭土：珍珠岩 9： 1 的混合基质，代森锰锌灭菌 ,优化环境控制，可获得 78 100移栽成活率和健壮的植株苗。 （ 5）使用 石蜡包埋法制作生根苗正常根系与膨化根系幼嫩根段切片，观察发现膨化根系的膨化部位发生在皮层部分。膨化根系皮层厚度异常增加，细胞体积增大，形状不规则，排列无序；膨化严重的材料，其皮层细胞解体。 （ 6）使用 0000描生根苗正常根系与膨化根系，005b 对结果进行分析发现，正常根系与膨化根系在根系体积、根系平均直径等指标上存在显著差异，正常根系根径级别主要分布在 1 4 级（ 0而膨化根系根径级别主要分布在 6 10 级 （ 关键词： 番木瓜 离体快繁 根系形态 根系结构 of in . 10642, .) is an in of as in a on On of of an in of as (1) to as on a a BA .2 0g/L 0in 0 5% 0s % in “ (2) At of , , 0g/L . as as (3) At of BA of BA in by at If S to a -3 in be a S .0 0g/L+ S 0g/L+AC by 0% 4) At of 8% be in 9： 1). (5) of an an of (6) to of be in a -4 . in 缩略词表 缩写词 英文全称 中文全称 6cm 米 d h 时 哚丁酸 霉素 L 升 mg 克 g lx 度单位 /勒克斯 钟 s mm 米 S 培养基 S 培养基 乙酸 性炭 乙烯基吡咯烷酮 pH 碱度；氢离子浓度 福平 霉素 录 1 前言 . 1 木瓜概述 . 1 木瓜离体培养研究进展 . 1 木瓜组培苗根系形态与细胞组织学观察研究进展 . 4 究的目 的和意义 . 5 2 材料与方法 . 7 验材料 . 7 物材料 . 7 器设备 . 7 要试剂 . 7 验方法 . 7 植体的选择、获取与预处理 . 7 植体的消毒方法的确定 . 7 染外植体的抢救方法 . 8 芽增殖培养中碳源的确定 . 8 代增殖培养基优化试验 . 8 根培养基优化试验 . 9 他几个影响生根率的因素探讨 . 10 同生根方法 . 10 同品种生根比较试验 . 11 性炭对生根的影响 . 11 定芽大小与生根关系试验 . 11 培养时间与生根关系试验 . 11 度对生根的影响试验 . 11 黄素对生根的影响 . 12 苗移栽 . 12 苗方式 . 12 栽步骤 . 12 管苗移栽成活的品种差异 . 13 栽基质与生根苗根系长度对移栽成活率的影响 . 13 常根系与膨化根系形态学比较 . 13 常根系与膨化根系组织学比较 . 13 料准备 . 13 定 . 13 洗 . 13 色（媒染、整染、冲洗） . 14 水 . 14 明 . 14 蜡 . 14 埋 . 14 块的分割、修整与固着 . 14 片 . 15 片、展片与烤干 . 15 蜡及封固 . 15 检、观察与拍照 . 15 验观察与数据统计分析方法 . 15 3 结果与分析 . 16 植体消毒方法的确定 . 16 菌污染材料的抢救 . 16 同碳源对不定芽增殖的影响 . 16 本培养基及植物生长调节剂的种类和浓度配比对继代增殖的影响 . 17 本培养基及植物生长调节剂种类和浓度配比对生根的影响 . 19 他几个影响生根因素的探讨 . 20 同生根法的效果比较 . 20 同品种的生根效果差异 . 21 性碳对生根的影响 . 21 定芽大小对生根的影响 . 22 培养时间对生根的影响 . 23 温度对生根的影响 . 23 黄素对生根的影响 . 24 培生根苗的移栽 . 26 苗方式的比较 . 26 栽成活率的品种差异 . 26 根苗根系长度与移栽基质对移栽成活率的影响 . 27 常根系与膨化根系形态学与组织学比较 . 28 态学比较 . 28 常根系与膨化根系直观形态差异比较 . 28 常根系与膨化根系的直径分布差异 . 28 化根系与正常根 系形态学指标差异 . 29 常根系与膨化根系组织学比较 . 30 4. 讨论 . 31 于外植体的选择与表面消毒 . 31 于增殖继代培养 . 33 养基优化问题 . 33 代增殖过程中的玻璃化现象 . 34 于生根培养问题 . 36 步生根与两步生根法优缺点比较 . 36 养基优化问题 . 37 响根系发育的其它几个重要因子 . 38 响移栽成活率的因素 . 40 管苗移栽后易于死亡的原因 . 40 试验中五种不易移栽成活的试管苗类型总结 . 41 苗技术与环境控制对移栽的影响 . 42 栽与炼苗过程中需要注意的其 它问题 . 42 5 结论 . 43 致 谢 . 44 参 考 文 献 . 45 附录： 图版及其说明 . 51 位论文原创性声明 . 62 学位论文版权使用授权书 . 62 1 1 前言 木瓜概述 番木瓜（ .）隶属番木瓜科（ 木瓜属（ , 是一种重要的半草本热带亚热带果树，别名木瓜、万寿果、石瓜、乳瓜等。原产于南美洲巴西，约于 17 世纪引入我国，在我国南方有较大的种植面积，华南地区种植面积约 6,667内以广东、广西、福建、云南、海南、台湾、四川等省栽培面积较大（林冠雄等， 2005）。 番木瓜植株是多年生软木质小乔木，干直立；叶大，掌状深裂；花两性或单性异株；花萼小，下部联合，上部 5 裂；雄花冠长管状；雌花花瓣 5；雄蕊 10 或 5（两性花），近基部合生； 子房 上位， 1 室，有多数的胚珠生于侧膜胎座上；果为一浆果。 番木瓜品种颇多，栽培容易，生长迅速，结果快，单秆直立适于间作，常年结果，产量很高（林启训等， 2000）。但其花性复杂，种子繁殖后代的农艺性状，特别是果形、果肉、颜色等变异较大，雌性花结的果为卵形 ，果腔大，种子多，果肉薄，不耐贮运，而两性花结的果为长椭圆形，果腔小，种子少，果肉厚，耐贮运（叶长明等，2003）。 番木瓜果肉鲜美，营养丰富，用途广泛。果实中除含有人体所需的蛋白质、脂肪、糖类和丰富的矿物质、维生素外，还含有木瓜蛋白酶（ 营养价值较高，故其可以作为新鲜水果食用，又能入菜煲汤，重在益脾健胃和帮助消化，治疗十二指肠胃溃疡。木瓜凝乳蛋白酶（ 医用价值更高，对人的腰脊椎盘突出症疗效显著（朱利显等， 1983）。目前已经分离、纯化出上述两种酶类，并获得了其中含有的 “融 菌酶 ”，对促进伤口愈合、防止感染、以及水果和食品保鲜都有重要的意义（朱西儒等， 2001）。近年来，番木瓜也因上述独特的风味和保健价值而跻身高档水果行列，享有 “岭南佳果 ”的美誉。 除此之外，番木瓜还可用于多种深加工，其果实本身及未成熟果实中富含的木瓜酶类是食品、医药、饮料、饲料、化妆品和生化等工业领域的重要原料和辅料（叶长明等， 2003），因此，发展番木瓜种植及相关产业都有广阔的市场前景。 木瓜离体培养研究进展 植物组织培养是 20 世纪发展起来的一门技术， 30 年代中期其技术体系基本建立。 1937 年 立起第一个植物组织培养的专用培养基，使这项技术在果树学 2 上得到广泛的应用，特别是 于划分快繁阶段的理论和实践，有力地推动了木本果树的快繁应用。 林顺权等（ 2005）总结了园艺植物离体培养再生植株的主要途径： 萌发腋生枝 诱导根 完整植株（ 1）（茎尖） 外植体（脱分 产生体细胞胚 进一步发育为完整植株（ 2） 化）或愈伤组织 同时有根茎原基 连接为植株（ 3） 产生不定器官 根上长茎 植株（ 4） 单极原基 茎基长根 植株（ 5） 在番木瓜离体再生中采用最多的是途径（ 1）、（ 2）和（ 5）。 番木瓜生物技术研究始于 20世纪 70年代中期，早期主要是组织培养技术的探讨。随着研究的深入，番木瓜无性繁殖离体再生体系已经建立。 1974 年， 首次报道从叶柄诱导形成愈伤组织获得 成功。 （ 1978 ）采用番木瓜的茎尖和叶柄在 养基上成功地培养了试管植株。随后，从茎尖或 顶芽、侧芽（ 1983）、胚、花药、子叶和子房（ 1982）等 培养中，相继报道成功地再生植株。有关体细胞胚发生的报道也不少， （ 1977）从幼年实生苗茎部的愈伤组织诱导产生的体细胞胚获得成功； （ 1974）从叶柄来源的愈伤组织诱导产生了体细胞胚，但他们都未报道体细胞胚是否培养出小植株。直到 1982 年， 才从胚珠来源的愈伤组织诱导产生体细胞 胚，并再生植株获得成功。此后， （ 1987）和 （ 1987）也成功地从根外植体诱导产生体细胞胚和再生植株。我国学者叶克难等（ 1991）、黄俊潮等（ 1993）以 杂种小苗的根、茎为外植体，通过悬浮培养途径，经愈伤组织诱导获得大量体胚并再生植株。邹韵霞等（ 1992）对番木瓜的受精胚珠进行培养，获得胚性愈伤组织、体胚和正常小植株。周鹏等（ 1992）则用实生苗叶片为材料，通过愈伤组织诱导获得胚状体和再生植株。 (1974)， （ 1975）， （ 1978）对 （番）木瓜的组织培养进行初步研究，并在探索适合番木瓜组织培养的外植体类型、培养基配方及最佳培养条件方面取得了进展与突破。 1993）通过番木瓜种子幼胚下胚轴愈伤组织分化建立了高频体细胞胚胎发生与植株再生体系，提出了诱导下胚轴胚性愈伤组织发生 3 的激素和蔗糖水平，在诱根阶段使用 固体培养基，时转入 “蛭石培养基 ”（ 燥的蛭石与 体培养基等体积混合，高温高压灭菌），至根系发育良好后移入花盆培养。在外植体方面，（ 1994）做了更多的尝试，他采用番木瓜叶片、小叶柄、茎段和根为外植体进行愈伤组织的培养，试验结果指出，胚性愈伤组织的诱导，其发生率很大程度上与外植体的选择有关。胚性愈伤组织诱导、生长和其表现型的决定因素是外植体的来源，但培养基的激素成份也是一个重要的因素。通过愈伤组织可以分化出大量丛芽，继而增殖培养，最后可在 1/2 的培养基上培养生根。 （ 1987）以根为外植体，在含 养基上培养三个月、 （ 1983）以胚珠为外植体，在附加 20%椰乳的 1/2养基上培养三个月，均获得了体胚。另外，叶克难等（ 1991）以根、茎为材料，通过悬浮培养，获得了大量体胚并再生植株；朱西儒等（ 2001）以叶为外植体，诱导胚性愈伤组织并实现了植株再生。 离体培养再生植株途径中，茎尖培养可以直接诱导腋生枝萌发。对于离体快速繁殖而言，茎尖和侧芽是最好的外植体选择。关于番木瓜茎尖和侧芽的组织培养已有较多的报道，基本技术体系已经建立，其中 番木瓜顶芽与侧芽的组织培养中有着杰出的贡献，尤其是试管苗的生根阶段，对根系的发生机理和根系的生长发育进行了深入的研究。 在对番木瓜茎尖、侧芽组织培养的影响因素进行研究时， （ 1997）以番木瓜茎尖为外植体，研究了茎尖培养中铁螯合物（ 光照水平的交互作用。 （ 1986）也发现培养基中的大量元素、微量元素、有机物和铁螯合物对番木瓜顶芽侧芽的诱导、增殖和生根有很大的影响， 大量试验的基础上建立起一种新型高效的基本培养基 养基。并以此为基础进行了大量的生根研究。 大量研究表明，生长素的种类和浓度的组合是影响根系诱导发育的重要因素。 1987） 分别将 4 种不同浓度的生长素 氯苯氧乙酸）、 独加入培养基中，结果发现 10 的 适合诱根，但高浓度的生长素会产生粗短的根和矮化的植株。曾继吾、易干军等（ 2003）发现，番木瓜体胚发生的试管苗根系诱导和分化率低，最高生根率仅为 且生根根系质量差，根多疏松或成水渍状，含水量高，容易脱水，在后来的移栽过程中成活率不高。窦敏等（ 2003）在番木瓜组培快繁试验中也遇到了类似的问题，生根率 60 70%。这可能与 4 生长素对根系诱导、根系发育的影响作用有关。 （ 1990）认为发达的根系产生于无生长素的培养基中， 1992）提出 番木瓜根的诱导阶段是必要的，在伸长阶段却起阻碍作用。因此采用两步生