【毕业学位论文】（Word原稿）博莱霉素高产菌株选育及其发酵培养基优化微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 博莱霉素高产菌株选育及其发酵培养基优化 I 摘 要 博莱霉素是一族具有独特结构和作用的广谱抗菌抗肿瘤抗生素 ,由 5个氨基酸、 2个六碳糖和 1个胺基侧链构成 ,各组分分子结构间差异仅在于胺基取代侧链的不同。博莱霉素对头颈部鳞癌、恶性淋巴瘤有效 ,且 不引起白细胞减少 ,不抑制机体免疫功能 ,也不损害造血系统。博莱霉素杀伤肿瘤细胞的机制是在体内与铁、氧结合生成复合物 ,与染色体作用后进攻 引发 从而抑制肿瘤细胞 目前博莱霉素的效价很低，而本实验的出发菌株 5 g/了提高效价，实验通过五种方法分别对博莱霉素出发菌株 后通过 N+离子注入选育出高产菌株 对原始发酵培养基进行优化及前体加入浓度和加入时间进行了选择，使博莱霉素的效价显著提高。研究结果如下： 波、 亚硝基胍、电子束、离子注入五种方法分别对效价为 25 g/外线、微波、亚硝基胍、电子束初筛的高产菌株进行摇瓶复筛时效价都有不同程度的降低，传代进行遗传稳定性测验时高产菌株都不稳定，退化现象明显，效价降低幅度很大，基本没有利用价值。而 最后 通过 N+离子注入选育的高产菌株 g/出发菌株的 ，而且该菌株的效价非常 稳定，传代 5 g/ 高菌株 发酵效价 。并通过对无机盐、碳源、氮源的正交设计选择各组分在发酵培养基中的最适浓度，选择出不同于原始发酵培养基的最佳发酵培养基，此时博莱霉素的效价可以提高到 g/后通过对加入前体的浓度和加入时间的选择进一步提高博莱霉素在发酵液中的含量。结果表明 36h 加入浓度为 前体精胺可以使博莱霉素的效价进一步由 g/高到 g/ 关键词 ：博莱霉素，菌株选育， 正交设计，培养基优化，前体 is a of of 2 of of of is in is in of of LM is NA by LM At LM is as of is 5g/to 5 to At by + he of LM 1. of by V, + of of to in by In of of by + as as of is 2. In to of In to an of by of mL In in to LM in is LM be mL mL of ml 6h. 录 摘 要 . I . 一章 引言 . 1 莱霉素的研究进展 . 1 . 1 . 1 . 3 . 3 生素产生菌的菌种选育 . 4 . 5 . 7 . 15 酵培养基的优化 . 18 第二章 博莱霉素高产菌株选育 . 20 料和方法 . 20 验材料 . 20 验方法 . 21 果与分析 . 25 莱霉素标准曲线的绘制 . 25 物量、 价的变化曲 线绘制 . 25 外线对 孢子诱变 . 26 波辐射对出发菌株的诱变 . 29 . 31 子束辐射 . 33 子注入诱变 . 35 论 . 37 第三章 发酵培养基优化 . 39 葡萄糖变成淀粉 . 39 肉膏添加实验 . 39 机盐对效价影响 . 39 源的选择 . 41 源的选择 . 43 体对博莱霉素效价的影响 . 45 . 45 . 45 论 . 46 四章 结论和讨论 . 47 参考文献 . 50 致 谢 . 59 作 者 简 历 . 60 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 莱霉素的研究进展 博莱霉素 (一组含肽的抗生素 ，分子量约 1500。 1966年日本的 酵产物中发现。它是一个由 10 余种组分组成的混合物 ,通过纸层析和柱层析可以得到 族成分 5、 天然产生的轮枝链霉菌发酵培养基中分离得到的博莱霉素是含铜的复合物 ， 而临床应用的则是去金属化合物 ,这样可以降低注射部位的疼痛感。目前国内外使用的博莱霉素主要成分为博莱霉素 这两种成分对人毒性小，抗癌作用强 ，在博莱霉素混合物中 分别占 55%70%和 25% 32%， 已广泛用于临床。博莱霉素 毒、肺毒性低的抗癌抗生素组分。博莱霉素 、肾无害，不损伤人体自身的免疫功能和骨髓造血功能。 博莱霉素 进入人体后很快集聚于皮下、肺部、睾丸等处，对淋巴瘤、鳞状细 胞癌、肺癌和睾丸癌等具有很好的疗效。博莱霉素 抗肿瘤的主要机制是直接作用于 单链断裂。 博莱霉素 上的糖链对癌细胞有一定的识别作用，从而使它能较专一地进入癌细胞破坏 1993 年 报道博莱霉素 对 有一定的降解作用，但作用效率比对 得多，其作用位点与其在 要作用于 。目前对 博莱霉素 的研究重点主要在两个方面，其一是研究 博莱霉素 切割 二是根据已得的信息，人工合成新的低毒高效抗肿瘤药物。 莱霉素的药理和毒副作 用 博莱霉素是一族具有独特结构和独特作用的广谱抗肿瘤抗生素。研究证明它能有效地抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、枯草杆菌等具有较强的抗菌作用。对头颈部鳞癌、恶性淋巴癌等有疗效。另外博莱霉素与亚德里亚霉素和长春新碱连用进行化疗，可以治疗与爱滋病相关的 肉瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，并取得了肯定的疗效 (992)。而利用博莱霉素破坏 特性，与其他抗病毒药物联用可提高对爱滋病的疗效。 博莱霉素最常见的毒副作用是发热、黏膜炎、脱发、 厌食、恶心、呕吐和色素沉淀；大剂量给药时对肾功能有一定的影响；最严重的毒副反应为肺炎样症状，可引起不可逆的肺纤维化。临床病例表明，患者肺炎样症状出现率大于 10%，而由不可逆肺纤维化导致患者死亡率约为 1%。 莱霉素体内作用机理和分子结构 当博莱霉素被注射到体内时，首先与血液中的铜离子结合形成络合物，一旦进入肝脏，被肝脏酶还原脱去铜离子生成博莱霉素单体，再与铁离子结合进而与 合形成络合物。络合物与螺旋结构的小沟经过特异性核酸序列的识别而键合。而博莱霉素的双噻唑基团具有共平面性和芳香性，与 核酸碱基以部分插入的方式结合。通过形成的色散力使超螺旋的 弛，然中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 后释放自由基，引起 解反应，干扰 制（ 1998 ）。 (1997)曾报道改变末端胺基而使博莱霉素肺毒性降低。杨铭等（ 1995， 1997）通过光谱分析、黏度测定及 1究了博莱霉素 互作用的分子机制，探讨了博莱霉素 同系物对小鼠肺毒性的差异与不同尾链结构的关系。他们还应用快速酶联免疫法 ( 及 迹杂交法研究了博莱霉素同系物诱导癌基因表达的作用。博 莱霉素的活性不仅限于铁 破坏作用，高浓度的博莱霉素还能够切断 许多位点，释放出尿嘧啶和腺嘧啶。博莱霉素还可以与其他离子作用，包括 V 也可以使 效果不如铁明显，且除需要需要其他条件如光照、 990）。 博莱霉素由 5个氨基酸、 2个六碳糖和 1个胺基侧链构成 ,各组分分子结构间差异仅在于胺基取代侧链的不同，见图 1所示。博莱霉素发酵时，在发酵培养基中加入天然或非天然博莱霉素的末端胺，可以抑制其他天然博莱霉素的生成，并 生成包含该种末端胺的新的博莱霉素产物，这种现象叫前体效应。在摇瓶培养的初始阶段加入末端胺前体，这种现象就开始表现。 胺基烷基衍生物如胺、胍、锍等也可以结合至博莱霉素成为末端胺基团， 这样可以使用不同的末端胺对不同的博莱霉素进行生物合成。 图 1 博莱霉素分子结构 2 嘧啶 ,3 缬氨酸 ,4 苏氨酸 ,5 末端胺 , 6 7 联噻唑 ,8 古洛糖 ,9 甘露糖 ,10 氨甲酰博莱霉素 R = R = ； 1: 4: 博莱霉酸 R = 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 3 莱霉素产生菌的基因工程改造 博莱霉素全合成、半合成和直接合成已经产生了许多博莱霉素同系物。但全合成受费用限制，半合成和直接合成只能变更某些官能团。这样随着分子生物的发展使得对博莱霉素产生菌轮枝链霉菌在基因水平的研究和改造成为可能和必然。 973)等通过加入 14C 和 13C 标记物的方法研究了博莱霉素的生物合成，表明博莱霉素糖苷配基是由一个丝氨酸、两个天冬氨酸、一个丙氨酸、一个乙酸酯、一个苏 氨酸、一个 莱霉素表现出肽（ 多聚乙酰（ 生物起源，被认为是一种天然肽和多聚乙酰生物合成的异源代谢产物(1999)。 过非常相似的方式重复装配延长的基团，氨基酸通过非核糖体多肽合成酶（ 成长链。每个系统都包括一个标准模式的操作来确定装配的数量、顺序、末端结合单位特异性和使用同一个 4 博莱霉素合成酶应该是由 成的一个功能体系，从而催化氨基酸和乙酸酯生成代谢产物。 克隆博莱霉素生物合成系统的基因的尝试开始于 1994 年， (1994)由博莱霉素产生菌 克隆出两个抗性基因 在大肠杆菌中得到超量表达，产生的蛋白也得到纯化 。 由 点进行染色体步移，以 探针， （ 1994）分离出来自 因库包含抗性区域的 质粒克隆片段。在 到确认。 (1979)对 游区域进行了步移测序，确认了另外的七个开放性的阅读框，但并没有发现 1995)采用与 过染色体步移与 们在克隆了 33 个开放性阅读框后发现了一个 ，而在此 上游有五个 系，并推测其功能。另外 (1979， 2001)克隆并讨论了博莱霉素生物合成中的一个关键酶磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因。克隆博莱霉素生物合成基因簇为通过多基因控制的博莱霉 素生物合成产生新的博莱霉素类似物奠定了基础，而对 因所进行的结构改造能够产生具有更好选择性和抗肿瘤活性的新博莱霉素药物。 莱霉素国内外研究进展 博莱霉素在国家“十五”攻关项目前三年的工作中，首先对已有的博莱霉素产生菌和生产工艺进行了深入研究和优化，在较短时间内定向地获得了高产菌种。通过改进发酵条件特别是通过前体加入法使现有的发酵水平有了较大幅度的提高。并使博莱霉素 有效组份中的含量比从10%提高到 50%通过中试验证了前体物合成的制备路线并得到了足够量的前体物，为发酵工艺产业化试验打下了基础。通过小型自动发酵罐发酵，为放大发酵提供了必要的参数和条件。已经进行的规模化放大发酵试验也取得了较好的结果。 国外的博莱霉素是日本 学者 60年代发现 的抗生素，由十余种活性组分组成，主要组份为 2。经临床应用 30多年证明确实有效，且不损害免疫和骨髓，也不损害心、肝、肾。但缺点是抗瘤谱不够广，有较严重的肺毒性。肺炎样症状发生率在 10%以上，有 1%以上的病人因产生不可逆的肺纤维化而死亡。因此寻找抗瘤谱广、有特点，且肺毒性低的新品种乃是这类药物开发研究的中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 4 重要目标。为此，国内外均进行了大量 的工作。成功的例子是七十年代中晚期，日本开发的末端胺为苯乙丙双胺，该化合物的抗瘤谱比原来的博莱霉素广 ,可用于扁平上皮癌、喉癌、阴茎癌 ,也可用于胃癌和前列腺癌等。不良反应比博莱霉素轻，临床出现肺毒性反应的病例为 约有 病人发展为弥散性间质性肺炎。 在国内，六十年代末我国从土壤中分离出了博莱霉素产生菌，七十年代初，即研制成争光霉素。开始是以混合物的形式制成制剂，用于临床肿瘤化疗。七十年代中期，发现我国争光霉素复合物的组分与博莱霉素复合物相比差别很大。其中 分一般可达 50%尤其 分也可达10%以上。我国 对博莱霉素 成功开发，使得这个化合物于八十年代初，即以单组分被命名为平阳霉素，用于临床肿瘤化疗， 1982年获国家二级发明奖。平阳霉素的重要特点是抗瘤谱广，其肺毒性与 致相当，近二十年来发挥了良好的作用并于 1990年收入我国药典。 依据日本七十年代早期的文献报导，在博莱霉素复合物中， 含量只有痕迹量。他们发现，对大多数博莱霉素组分来说，向培养基中加入特定组分的末端胺前体，发酵产物中的特定组分含量比会大幅度提升而其他组分的产生则不同 程度地被抑制，但博莱霉素 是个例外，向培养基中加入其末端胺前体 (精胺 )，发酵产物中的博莱霉素 仍只有痕迹量。所以国外对 今未进行深入研究和开发。 博莱霉素族抗生素在临床应用的突出特点是在治疗过程中没有常用抗癌药物所引起的白细胞减少 ,也不抑制机体的免疫功能 ,这对癌症患者的治疗是十分重要的。博莱霉素对肿瘤细胞的选择性毒性是因为肿瘤细胞比正常细胞更容易吸收博莱霉素。当通过与可视核磁共振或放射性金属离子联合使用时 ,博莱霉素就可以作为肿瘤显影试剂或放射性治疗试剂使用（ 1996）。博莱霉素对 正常细胞也有毒性 ,皮肤和肺是特别敏感的组织 ,因为这些组织中博莱霉素水解酶含量相对较少。但是博莱霉素与单克隆抗体偶联 ,则能选择性与肿瘤细胞结合 ,体内外抗肿瘤作用更强（刘小云 ,2000）。博莱霉素特异性识别并切割 使其成为核酸研究的有效工具。研究博莱霉素识别及切割 将为人工设计新的抗癌药物开辟一条途径。另外 ,研究博莱霉素与酶概念的关系 ,在理论上也有重大意义。尽管国内外的科研工作者为改进博莱霉素的抗肿瘤作用 ,扩大临床使用范围 ,降低肺毒性已进行了不懈的努力 ,并取得了显著的成效 ,但至今包括克服 耐药性等问题仍是摆在博莱霉素族抗生素研究工作者面前的问题。 博莱霉素对癌症患者来说是一个福音，但是目前博莱霉素的生产水平很低， 无法进行大批量工业化生产， 因此如何提高其产量便成为一个很重要的问题。例如通过对发酵培养基和培养条件的优化提高博莱霉素的发酵水平，通过诱变育种或者基因工程的手段改变出发菌株的性能，从源头上提高菌株的产素能力。 生素产生菌的菌种选育 抗生素的出现在医学上开创了化学治疗的新纪元，使很多传染病得到了控制，在保障人类健康方面起到了极其重要的作用。除了在临床医学中应用之外，抗生素还在防 治动植物病害、刺激动植物生长、保藏食品以及工业等方面发挥着越来越重要的作用；同时，抗生素的发展对基础科学如有机化学、药物学、生物化学和微生物学等学科提供了新的技术和内容，特别是抗生素作为中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 5 一个分子生物学研究的重要工具以及对其作用机制的深入研究更是推动了分子生物学科的发展。 抗生素的工业化生产为实现抗生素的巨大价值提供了有力的支持。然而，对于一种抗生素的工业化生产，它的产生菌的菌种质量是关键因素，因为这决定着该抗生素开发和发展的前途。如何改善抗生素产生菌的菌种质量以满足工业化生产的需要是自从 1929年 现第一个抗生素青霉素以来，人们始终坚持不懈进行探索。抗生素产生菌的菌种选育技术是人们多年来围绕这一问题不断深入研究的结果。近年来，随着人们对微生物遗传学方面基础理论研究的日益深入以及基因工程技术的飞速发展，抗生素产生菌的菌种选育技术可以说是发生了深刻的变化。 现代基因突变的研究开始于 1909 年，那时从红色复眼的果蝇中间发现了一只白色复眼的果蝇，这一突变是自然发生的，称之为自发突变。 1927 年，美国昆虫学家 现 人为控制突变的开始。 1942 年， 发现氮 芥也能诱发果蝇突变，从此开创了人们利用理化因子来进行工业微生物菌种 (特别是抗生素产生菌 )选育的主动地位。微生物的诱变育种约始于 1939年 20 世纪 40年代初， 用 得了各种代谢障碍的突变株，并于 1941年提出“一个基因一种酶”的学说；阐述基因与酶功能的直接关系，使遗传学从细胞水平发展到分子水平，促进了工业微生物育种技术的发展。随后 系统地总结了在青霉素产生菌中的 种系谱，为世界许多国家提供了青霉素高产变种。 60年 代， 分别从各方面综合了微生物育种经验，并总结出了一些规律，但当时仍在不断实践中。 60 年代末，国际粮农组织和国际原子能机构组织了利用各种理化因子来改善农作物品系的培训班，并发表了突变育种手册，为诱变育种奠定了理论基础，从而完成了从初期基础研究向实际应用的转折。 70， 80年代，在抗生素产生菌诱变育种中有关诱变的方法以及突变体的筛选方法等有了很大发展，同时分子遗传学和分子生物学技术的广泛应用也为诱变育种注入了新的活力，特别是 90年代分子标 记方法的运用以及人们对诱变规律和微生物遗传学知识的进一步了解，使得定向诱变有了可能。 在我国，抗生素工业起步于 50 年代，抗生素产生菌的诱变育种也起始于那个时间。 80 年代以来才真正进入加速发展阶段，特别是在新诱变因子的开发上，我国的科研工作者作出了巨大贡献。进入 90年代，诱变机理研究进一步深入，育成菌种的数量及质量也大大提高，但和世界发达国家水平相比，我国的抗生素产生菌的诱变育种无论是在基础理论研究上还是在生产实践上都还有较大差距。 尽管随着现代生物技术的发展，将目的基因导入宿主菌，进行克隆和表达，从而构建基 因工程菌的报道已有不少，但基因工程菌用于大规模工业生产的还为数不多，经典的诱变育种仍是目前最重要的遗传育种手段，特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少。目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的理化因子等诱变方法。 生素产生菌菌种选育的应用情况 随着诱变育种理论知识的深入和生产实践的提高 ,抗生素产生菌的菌种选育得到广泛应用，主要表现在以下几个方面： （ 1）提高生产能力。 从自然界分离到的抗生素产生菌的野生型菌株，生产能力通常很低，不能作为生产菌种，但野生型菌种经过诱变选育后，生产 能力往往可提高几十至几百倍。例如 :中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 6 经过一系列的物化诱变处理，同时结合培养条件的优化，在 40多年内，青霉素产生菌的生产能力增加了 300 多倍，达到了目前的 60000 U/89000 U/时，在其他抗生素 (如链霉素、金霉素、地霉素等 )产生菌的选育中也取得了巨大成绩。 （ 2）改善抗生素的品质。 抗生素产生菌产生的抗生素，往往不是单一的，而是多组分的混合物。通过诱变育种可将其中有毒的或活性弱的组分除去，同时也可增加有效组分或添加新组分。柱晶白霉素产生菌的野生型菌株的菌丝有一定的毒性，四川抗菌素工业研究 所的孙益 (1994)等，利用常规理化因子对其进行诱变处理。结果不但改造了菌株菌丝有毒性的不良性状，而且还使得发酵产品中主组分 含量显著提高。小诺霉素是一种抗菌作用强，毒性底的广谱抗生素，但在刚投产时由于副组分含量较高，该抗生素的品质受到了非常大的影响。后来经过多年的诱变育种及发酵工艺调控，小诺霉素主组分的含量才逐步上升。 （ 3）合成新的抗生素产品。 诱变某些抗生素产生菌，去掉或改变抗生素母核上的某一功能团，可以得到疗效更好的新品种，称之为突变生物合成 (如用亚 硝基胍诱变红霉素产生菌波赛链霉菌 (获得一青色突变株能产生新品种阿霉素。阿霉素是红霉素母核上 14位置的 14霉素仅对白血病有效，而阿霉素对人类急性白血病及多种实体瘤均有疗效。通过诱变筛选还可以得到原抗生素母核上较复杂基团发生改变的新抗生素产生菌。目前，在氨基环醇类抗生素，如新霉素，庆大霉素和巴龙霉素生产菌的选育中，正试图用所谓突变生物合成方法来达到这一目的。诱变筛选不能合成抗生素某一组分的突变株，这类突变株只有在添加了它不能合成 的组分时才能合成原抗生素。由于次生代谢产物生物合成过程中，某些酶专一性不强，所以若添加的不是合成原抗生素所需要的组分，而是其结构类似物，那么就有可能得到组入原抗生素不同类似物的多种新抗生素。例如，诱变新霉素产生菌，得到一株不能合成新霉素的一个组分 2 一脱氧链霉胺的突变株，在它的培养液中加入不同的前体类似物，如链霉胺等，即可分别获得含有这些前体类似物的新抗生素。 （ 4）改善抗生素产生菌的性状。 通过诱变选育还可改善抗生素产生菌的某些特性，以适应生产上的设备和条件，并可简化工艺条件，缩短发酵周期，增加设备以及 原料的利用率。如土霉素生产中选得了减少泡沫的变异菌株，从而提高了发酵罐的利用率；又如青霉素发酵液中需要添加昂贵的苯乙酸或苯氧乙酸为前体，才能有效地合成青霉素 G，诱变筛选氧化苯乙酸能力低，结合前体进入青霉素分子能力强的突变株，可大大提高前体的利用率。 （ 5）用于研究推测抗生素的生物合成途径。 在研究抗生素生物合成过程和抗生素形成的遗传机制方面，抗生素产生菌的诱变也是一种非常有效的手段。在研究抗生素的生物合成途径时，人们利用一些常规的人工诱变方法，使抗生素产生菌失去产抗生素或其中间体的能力，就可分离得到抗生 素生物合成的各种不同障碍型突变株。这些突变株能够积累某种中间代谢产物或支路代谢产物，从分析产生菌和突变株的代谢产物的化学结构上的差异，找出这些代谢产物在合成过程中的相互关系，即可推断其生物合成的反应步骤，再分离其反应中的特殊酶类，可判断其生化反应的特性。在这些突变株中，抗生素阻断型突变株 (亦被称为抗生素零突变株 )便是常用的一种，它是指目标抗生素分泌为零的突变株，历来都是判明抗生素生物合成途径有关基础理论研究的好材料。例如顶头孢霉 (头孢菌素 C(物 合成途径的阐述就是采用了若干这样的突变株。同时，零突变株如发生回复突变往往能筛选到产抗生素能力大幅度提高的突变株，这种迂回跃进战略在抗生素高产菌株的选育方面也是非常有效的途径。通过诱变育种中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 7 便能得到这种突变体。 976)等利用诱变获得了一株不产庆大霉素的阻断型突变体，利用它对庆大霉素的生物合成途径进行了论证和推理。廖爱芳 (1996)等对西索米星原生菌株 行紫外线诱变后获得阻断型绿色菌株 用 对西索米星的生物合成途径进行了合理的推测。 （ 6）与其他育种方法相结合。 诱 变育种与其他方法相结合起来，往往会使得育种效率大大提高。如 :杂交育种是将两个亲本的有利性状组合在一起而获得良种的育种方法。在杂交前先分别诱变两个亲本，获得有利的突变型，然后再经杂交将有利的基因组合起来，比起单纯地将原始亲本杂交更能得到理想的效果。 除此之外，诱变还可获得各种类型的突变株，除了可直接提高产量外，有的是遗传研究工作中不可缺少的标记菌株，可应用于转化、转导、融合重组等；同时，这些突变菌株也拓宽了微生物的遗传种质资源，丰富了基因库的内容。 生素产生菌的菌种选育的方法 传统 的菌种选育方法主要是自发突变和诱变育种，近年来随着生物技术的发展，细胞技术和基因工程育种技术得到飞快发展。 然选育 自然选育是一种纯种选育的方法，它利用微生物在一定条件下产生自发变异的原理，通过分离，筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有水平的变株。因此，它能达到纯化、复壮菌种、稳定生产的目的。自然选育有时也可以来选育高产菌株，不过突变几率很低，进展很慢，基本不用这种最原始的方法。而高产菌株育种工作常采用诱变育种、基因重组。 变育种 诱变育种是指人工有意识地将生物体暴露于物理 的、化学的或生物等诱变因子下，促使生物体发生突变，进而从突变株中筛选具有优良性状的突变株的过程。由于它操作简便 ,速度快、收效大而且诱变手段多样 ,所以是实验室及生产菌株育种的主要方式。当前 ,在抗生素生产上常用的诱变剂主要包括以紫外线 ( )、射线 ( 、射线 ( 、快中子 ( )、5 2、烷化剂 (、等 )和吖啶类移码突变剂为主的化学诱变剂。在实际生产中 ,无论化学诱变剂还是物理诱变剂 ,单独使用很少能收到预期的效果。 所以生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法。灰黄霉素高产菌株的获得就是一个很好的例子。另外在操作过程中 ,不同的菌株对诱变剂的种类、剂量乃至处理的先后顺序要求是不尽相同的 ,朱昌雄 (1996)等曾对中生菌素高产菌株选育条件进行研究 ,选出了原生质体加紫外线处理的最佳方法。 并 通过此种处理方法获得了四株较原株效价高 50%90%的高产菌株。 另外随着现代科学技术的蓬勃发展，学科之间相互渗透相互作用 为抗生素产生菌诱变育种增添了活力。在传统的育种技术的基础上，激光辐照、离子束注入、微波诱变育种以及空间诱变育种等新技术新途径发展迅速，成为极为活跃的研究领域，呈现出良好的开发应用前景。现就这几种新技术在抗生素产生菌诱变育种中的应用情况及其作用机理作一阐述和分析。 (1) 激光辐照诱变育种 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 8 激光技术问世于 60年代，人们在微生物遗传育种的研究中，逐渐认识到激光作为一种物理诱变剂具有显著的成效，现在已经形成一门独立的技术 激光诱变微生物技术。与其他诱变方式相比，激光诱变具有操作简单、安全、变异率高、辐射损伤轻等优点。而激光与其它诱变剂的复合处理，也具有潜在的诱人的诱变效果。到目前为止，国内外关于激光诱变微生物已做了大量的研究 工作。概括起来，激光诱变微生物技术在两方面取得了卓有成效的发展。一方面是基础性的规律和机理的研究，为激光生物技术的应用作理论探讨。另一方面是应用性研究，归结为微生物的激光诱变育种，即激光辐照代替常规实验试剂或手段培育既高产又能稳定遗传的优良菌株。 对于激光诱变微生物技术的机理，国内外普遍比较认同的一种解释是光照活化效应。在激光辐照机体时产生光照活化效应（陈云琳， 2003），使核仁器抑制解除而被活化，并使 糖体上蛋白质合成作用的活性增强，使机体内的生物合成增强，特别是二羧酸 酶和细胞色素氧化酶活性提高，从而提高细胞利用氧的能力并增强细胞合成 能力。此外， 激细胞内外的生理再生过程和修复再生过程。一般认为光被呼吸链 (或称电子传递链 )的光受体吸收是光的生物反应的第一步，呼吸链中光受体的名称、构成、特性等也逐渐被人们所认识，而光在细胞内引起的一系列反应的结果，可能是对 而刺激微生物新陈代谢加速和生成繁殖速度加快。这中间的一系列反应和反应的中间产物及作用尚待深入研究。向洋等 (1994)用 育 株，其发酵液中庆大霉素有效组分 此可见，激光在提高抗生素的产量及有效组分含量方面具有广阔的应用前景。毛宁等 (1997)报道应用于生物体研究的激光大约只有 15种，通过分析工业微生物激光育种研究，指出工业微生物育种的种类主要有三种 :紫外激光，波长 260280间，主要适用于提高霉菌代谢产物为目的的育种；可见激光，波长 440700间，多用于原核微生物和酵母菌的育种；红外激光，波长9004500用于细菌的育种 。并指出 :激光对微生物的效应都是低剂量可促进生长或较高的正突变率，而高剂量致死率大，负突变率也大。采用营养体细胞的对数生长期进行激光辐照，剂量不宜太高。而采用孢子进行激光处理，则可相对提高剂量。此外激光诱变时菌悬液置磁力搅拌器上协同作用其效果与单纯激光处理不同。使被辐照的菌体置于无菌水中还是液体培养基中或固体培养基表面，因为不同培养基对激光的吸收不同，导致对菌体的诱变效果也不同。 激光和普通光相比，具有高方向性、高单色性和高亮度等基本特性。因此，一旦某种激光的频率和生物体内某种物质分子振动频率相等 ，