【毕业学位论文】（Word原稿）短季棉衰老的激素变化及衰老相关基因的克隆作物遗传育种博士论文

1 密级 公开 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 短季棉衰老的激素变化及衰老相关基因的克隆 of of in H. D 2 of of in 棉花叶片的早衰影响棉花的产量，导致棉花纤维强度降低、纤维长度变短、纤维整齐度下降，从而降低棉纤维的成纱质量，因此，从生理生化、基因的表达和调节控制水平上揭示棉花的早衰机制，对提高棉花产量，改善棉花纤维品质具有重要的意义。 （ 1）以陆地棉品种辽棉 9 号的去根幼苗为材料，对其进行暗诱导衰老培养，在培养液中分别加入 6 定在不同培养条件下棉花去根幼苗叶片内源激素、 活性和 量的变化，结果表明：棉花叶片衰老的可能过程首先是细胞分裂素含量的下降， 量的上升。 6钙离子均延缓叶片的衰老， 进叶片的衰老。 (2) 以 3 个生育和衰老特性不同的短季棉品种作材料，测定它们在生育进程中主茎叶内源激素含量的动态变化，结果表明：短季棉的早熟性与主茎叶早期吲哚乙酸（ 玉米素及其核苷（ Z+量出现高峰值的时间相一致，这两种激素高峰值出现的时间愈早，其产 量器官发育也早；短季棉的早衰性与主茎叶后期脱落酸（ 乙烯和 现的高峰时间相一致，而与主茎叶异戊烯基嘌呤及其核苷（ iP+量相反，短季棉始絮后，主茎叶 iP+量低、 乙烯含量高的品种易早衰，主茎叶 iP+量高、 乙烯含量低的品种抗早衰。 （ 3） 以辽棉 9 号衰老叶片的 模板，利用 术，克隆了棉花 因 ，注册号为 因序列的长度为 1368含一个 1034开放阅读框，起始于序列的 99位，终止于 1133 位，编码 344 个氨基酸。在棉花基因组中， 因是两个拷贝。 白质与其它植物半胱氨酸蛋白酶的氨基酸同源性为 67% 因编码蛋白质的分子量为 D，等电点为 蛋白质具有半胱氨酸、组氨酸和天冬氨基酸三个活性催化反应中心，是一个跨膜蛋白质，位于液胞膜上。 （ 4）基因表达分析表明： 在棉花的根、下胚轴、花、胚珠和幼叶中， 因不表达，在棉花的衰老叶片中 因表达。 细胞分裂素和蔗糖处理，可以抑制 因的表达， 抑制 因的表达，后期 因的表达量恢复到处理前， 双氧水处理，增加叶片 因的表达量。 氧水和黑暗处理未进入衰老叶片，不能增加的因的转录，这说明棉花 因是叶片自然衰老特异表达的基因。 （ 5）比较 中棉所 10 号和 中棉所 36 上部与中部棉铃纤维发育 蔗糖合成酶（ 活性和 与 果发现 ， 在棉花纤维发育的初期， 胚珠 活性和 录的下降，导致棉 3 花铃重的下降，开花 2后，其胚珠表皮细胞突起 活性与 录量下降，可导致纤维长度的下降、短绒增加。 花后 18， 蔗糖合成酶的活性和 录下降，影响棉花纤维的强度和伸长率。 关键词： 短季棉，衰老，激素， 半胱氨酸蛋白酶， 蔗糖合成酶 he of o 9 in in by 23187 in of DA in of 2DA in of SH OD be in to of to of OD of in on AA +ZR in on AA +ZR of iP+in on of iP+BA AA in On of iP+BA AA in A by of a of to to of CR 368 bp in a A)+ a (98 a 3 (235 A 6 bp A) 4 (44 D pI as a in D of in . an A of in to a of 7% 2% to of of in of a a 21. in of in 6 in On in be BA AA in in of of to in is to a to is a of on , 18, 27, PA in of at in at of of be as a in 5 目 录 中文摘要 主要符号表 第一章 文献综述 . 1 物衰老的细胞形态、生理生化变化 1 物衰老的细胞结构变化 1 物衰老的物质代谢变化 4 物衰老 的激素 变化 6 物衰老过程中的编程性细胞死亡 8 物衰老的基因调控 8 物衰老的细胞程序性死亡 9 物衰老与细胞程序性死亡的区别和联系 10 物衰老过程中细胞程序性死亡的可能机制 11 响植物衰老的环境因素 13 物学因素 13 生物学因素 14 物衰老的调控 14 老的可塑性及基因调控 15 老的内源激素调节 15 老的器官相关性调节 15 物衰老研究的展望 15 究的目的和意义 16 第二章 棉花叶片衰老过程中激素和膜脂过氧化的关系 17 料与方法 17 料的培养 17 绿素含量的测定 17 溶性蛋白质含量 18 胞分裂素和脱落酸的测 定 18 活性的测定 18 量的测定 18 据的处理 18 果与分析 18 诱导棉花叶片叶绿素和可溶性蛋白质含量的变化 18 6 诱导棉花叶片内源激素、 活性和 量变化 19 源激素对棉花衰老的影响 1 9 原谷胱苷肽和双氧水对棉花衰老的影响 19 和 棉花叶片衰老的影响 20 论 21 第三章 不同短季棉品种生育进程中主茎叶内源激素的变化 22 料与方法 2 2 料的种植 2 2 定方法 22 老指标调查 2 3 据处理 23 果与分析 23 同品种生育和衰老特性的差异 23 花主茎叶生长素含量的变化 24 花主茎叶细胞分裂素含量的变化 25 花主茎叶 量的变化 25 花主茎叶乙烯释放量的变化 26 论 27 第四章 棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆和表达分析 29 料与方法 29 验材料 29 验方法 29 提取 31 转录 31 的基因的分离 32 交分析 37 因的表达分析 38 40 花叶片外源激素、蔗糖和双氧水的培养 40 列的生物信息学分析 40 果与分析 41 花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆和序列分析 41 因的同源性和系统进化分析 44 白质特性和结构的生物信息学分析 45 白质的特性预测 45 白质高级结构的预测 47 7 因的氨基酸跨膜区段预测 49 因的 交 49 因的时、空表达特点分析 50 糖和双氧水对 达的影响 51 论 53 因的克隆和分析 53 白酶与细胞程序性死亡 54 因的表达特点 55 第五章 不同衰老特性 短季棉纤维蔗糖合成酶的差异比较 56 料与方法 57 料 57 法 57 料的种植 57 糖合成酶活性的测定 58 提取 58 反转录 58 糖合成酶 3 段的扩增、克隆和序列测定 58 58 果与分析 59 部和上部棉铃纤维品质的差异 59 纤维发育进程中蔗糖合成酶活性的变化 59 糖合成酶 60 纤维发育进程中蔗糖合成酶转录水平的变化 61 论 61 在棉纤维细胞分化中的作用 61 纤维发育过程中的 作用的生化基础 62 与棉纤维细胞壁的合成 62 第六章 结论与讨论 64 参考文献 67 附录 79 致谢 95 作者简历 96 8 主 要 符 号 表 英文缩写 英文名称 中文名称 落酸 成髓细胞病毒逆转录酶 基腺嘌呤 血清清蛋白 胱氨基酸天冬氨基酸蛋白酶 补 碳酸二乙酯 花后 硫苏糖醇 肠杆菌 化乙锭 二胺四乙酸 - 哚乙酸 戊烯基转移酶 丙醇 那霉 素 尔顿 B 培养基 二醛 新霉素磷酸转移酶 酸缓冲液 程性细胞死亡 of 端快速扩增技术 转录聚合酶链反应 老相关基因 准柠檬酸盐缓冲液 糖合成酶 端脱氧核糖核酸转移酶 羟甲基氨基甲烷 编码区 43 乳糖苷 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 9 第一章 文献综述 植物衰老是由内部因素控制，受外部因素影响的导致植物自然死亡的一系列衰退过程（ 980），在植物生长发育的不同阶段都可以发生，在发育生物学上有着重要的意义。首先，衰老可以使衰老器官中的营养物质转移到繁殖器官或其它生长旺盛的部分，使营养物质得以充分利用；其次，当植物受到环境胁迫时， 植物通过衰老消除局部损害，使植物度过逆境胁迫。由于衰老发生的早晚及衰老的时间直接决定了一个生物体或器官的寿命，所以衰老影响着作物的产量和品质，因此，认识植物衰老的机制和规律对于指导实践生产有着十分重要的意义。自从 20世纪初，人们就开始对植物衰老进行研究，发现了植物激素在衰老中的作用，并提出了营养亏缺理论，但直到 60 年代，关于植物衰老的一些实验，仍只是局限于植物器官（叶、花、果实）衰老中的形态学变化和生理代谢指标上。近年来，随着生物化学和分子生物学的发展，获得了衰老突变体和转基因抗衰老的植物，从而，使在分子水 平上阐述植物衰老的本质和机理成为可能，现在利用 差异显示技术（ 基因组差减杂交技术等方法，已分离克隆到许多衰老相关基因，证实了衰老的基因调控理论；利用启动子缺失和报告基因对衰老相关基因进行结构和功能分析，揭示了许多植物衰老的内部机制和信号传导。 物衰老的细胞形态、生理生化变化 在基因的调控下，植物衰老时体内发生一系列的形态和生理变化，主要表现在细胞结构、物质代谢及激素水平的变化上，由于这些变化又反过来影响着衰老的进程，所以对它们进行研究有利于揭示植物衰老的机理。 物衰老的细胞结构变化 胞膜和活性氧假说 植物衰老时细胞膜发生了关键性的变化（ 1997），由于衰老中基因表达的变化产生一些新的代谢酶，这些酶导致正常细胞膜脂类物质的代谢发生变化，膜的完整性受到破坏，选择透性消失，整个细胞的代谢紊乱，随后，发生膜脂过氧化，产生大量自由基。研究表明：在衰老过程中，磷脂酶 D 可以破坏细胞膜的完整性 ,在暗诱导的蓖麻子叶衰老过程中，发现磷脂酶基因的表达量增加。类囊体膜作为植物光合作用吸收太阳能的场所，除具有普通质膜的作用，还要进行光合作用电子的传递 ，类囊体膜降解机制不同于普通质膜， 1991 年发现，光合电子传递的损失发生在类囊体膜结构变化之前，说明类囊体膜的降解发生在衰老的晚期，但具体的降解机制仍需进一步研究。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 10 有许多实验表明 ,自由基对植物的危害很大，它可以攻击植物的蛋白质、核酸和脂类，使生物大分子受到损伤，能够引起膜脂进一步过氧化，产生丙二醛（ 较强交联特性，它可破坏生命活动正常代谢的进行。 20 世纪 60 年代， 出生物自由基伤害假说，该学说认为：衰老过程即活性氧代谢失调和积累的过程，在正常情况下，植物可以靠 本身的活性氧消除系统（酶系统和还原性物质），将植物代谢产生的自由基转化成 在植物进入衰老时期，植体内中产生大量的自由基 , 而植物体内的活性氧消除系统的活性下降，使植物的自由基的产生消除平衡受到破坏（杨淑慎等， 2001）。沈文飚等（ 1997）在研究小麦旗叶衰老时发现： 积累时间与旗叶衰老的时间基本一致，施用 有效地促进小麦的衰老，这表明能是叶片起始衰老的一个重要因子。但是，段俊等（ 1997）发现在水稻结实期间叶片衰老中叶绿素蛋白质下降与消除自由基的 、膜脂过氧化 物（ 间无直接的关系，认为它们都是叶片衰老后的一种结果，而非原因。推测：活性氧可能是一种信号分子，可以诱导衰老的发生，也可以加速衰老的进程。 1 1 1 2 气孔及气孔学说 气孔作为植物与外界环境的通道，它的开关与衰老有着密切的关系（冯晴， 1997）。有人认为 衰老调控的关键是 使气孔关闭， 导气孔开放。 980 年提出了叶片衰老的气孔学说，该学说认为：植物叶片气孔的不正常关闭导致了光合和呼吸失调，随后引起植物 白质代谢发生变 化，从而引发植物的衰老。如：当玉米去穗后，叶片的衰老加速，这是因为玉米去穗后，玉米失去了代谢的库，导致玉米代谢的源 合作用受到反馈抑制，气孔关闭，衰老加速。此学说还可解释干旱、盐分胁迫等条件下，引起的植物叶片衰老，当植物受到上述胁迫时，植物产生 起了气孔的关闭。近来研究表明：气孔的开关与衰老有一定的联系，但并非原因。这是因为 引起的黑暗中气孔开放，其衰老情况与光照下的衰老不同；而且并非所有的器官都有气孔。因此也有人认为：气孔关闭不是衰老的原因，也不是衰老的结果，在 一定条件下，两者可以彼此独立、相互并存（ ， 1993）。 1 1 1 3 叶绿体和光碳失衡假说 植物叶片衰老时，最早发生变化的是叶绿体。 1989 年在衰老的叶片中观察到叶绿体的数目、大小和组分都有所下降，同时伴有光合速率的下降。而光合速率的下降是叶片衰老的主要特征（ ， 2000）。那么这些变化是怎么引起的呢？翁晓燕等（ 2002）对水稻叶片衰老进行研究发现：水稻抽穗后，剑叶衰老过程中光合能力的下降与光合关键酶基因（ 达的下降密切相关，这暗示 植物衰老叶绿体与光合作用相关酶的合成减少。同时，叶片衰老时，水解酶的活性增强。叶绿体蛋白水解酶是由核基因编码、在细胞质合成，再转运至叶绿体中。中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 11 1993 年发现暗诱导衰老烟草子叶的叶绿体中有核基因编码的蛋白酶输入，而且衰老子叶的叶绿体的蛋白酶要比正常组织中输入的多；外施氯霉素，对衰老的作用不明显。但是，人 1991 年发现离体叶绿体 白的 亚基能在叶片衰老时有一蛋白质合成高峰，认为叶绿体衰老时也有叶绿体 与。可能是在叶绿体衰老的早期，叶绿体 作用，但在衰老的后期则主要由核基因编码的蛋白质起作用。现在已发现，在叶绿体中有一些依赖 蛋白质酶，其功能与大肠杆菌中的 相似， 1990 年 核基因组中找到 因，后来， 叶绿体基因组中找到 P 基因。当然叶绿体蛋白是许多蛋白的复合体，降解的酶和机制也可能存在多种。 由于叶绿体的衰退，正常的光合反应不能进行，这种现象与衰老的起始有关。张荣铣（ 1996，1997）提出植物衰老的光碳失衡假说认为：在正常情况下，光系统通过光合电子传递形成的光合还原物质，供应 碳氮同化，能量供应动态平衡，光合机构运转正常。但是，在叶片展开后，叶片中 性开始下降，并逐渐增快，能量的平衡被打破， 损耗变少，电子受体 乏，电子传递给 成超氧自由基，随之发生膜脂过氧化，使光合器官发生衰退，光合能力下降，当叶片光合能力低于一定阈值，叶片衰老启动。这和植物活性氧假说的机制基本相同，只是活性氧的来源不同。 1 1 1 4 过氧化物体 过氧化物体是植物叶片衰老时一个重要的细胞器，首先，它与叶绿体、线粒体一起完成光呼吸，参与脂肪的氧化、嘌呤的分 解，其次，它还能清除体内产生的 持细胞的基本功能。叶片衰老时，过氧化物体的数目迅速增加，过氧化氢酶逐渐消失，代替以抗坏血酸酶。冯晴等（ 2002）研究小麦叶片衰老时发现， 氧化氢酶）的活力比 坏血酸酶）的活力下降的早，且 力与 量呈显著负相关，同工酶电泳分析， 工酶谱带无变化，而 工酶带由 6 条增加到 8 条。过氧化物体发生的另一个变化是，过氧化物体向乙醛酸体转化， 的活性增加， 含量产生，这是由于衰老中，脂类氧化物需要在乙醛酸体上进 行，乙醛酸循环中苹果酸合成酶（ 异柠檬酸裂解酶（ 加，使 n 活性增加。 1 1 1 5 端粒酶和植物衰老的端粒学说 端粒位于染色体的末端是保护染色体结构完整的核复合蛋白质，早在 1920 年 现利用各种射线诱导果蝇染色体发生缺失、重复和倒位等突变时，在所有的果蝇突变体中，没有发现果蝇的染色体末端发生缺失或者倒位的突变体，这说明端粒对保护染色体的完整性具有重要的作用。当 行复制时， 后续链是不连续的，是由 导的冈崎片断组成，在 于末端 的 物的结合，导致 每次复制都可能丢失末端的几个碱基，随着 制的世代增加，生物的染色体会逐渐变短。原核生物通过其 环状结构来防止遗传物质的丢失，而真核生物为了防止自身遗传物质的丢失，在进化过程可能也有相应的机制，端粒酶的发现（ 1985）证实了真核生物防止遗传物质丢失的机制，端粒酶中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 12 是一种反转录酶，它以 模板合成相应的 Yu et 1990），以复制染色体的末端。 早在 1961 年， 发现，体外培养人的正常 细胞时，细胞分裂进行 50 代即停止分裂进入衰老的时期。 1973)推测，细胞停止分裂的原因是端粒的复制导致遗传物质丢失造成的， （ 1994）研究 22 个进入衰老的人的细胞系发现，在所有的细胞系中都没有检测到端粒酶的活性。在人类具有分生能力的器官（如肝细胞及皮肤和肠道上皮细胞）和生殖细胞中，端粒酶的活性高，而在分化的细胞中没有检测到端粒酶的活性（ et 2003）。虽然植物细胞具有全能性，但是植物细胞的端粒酶活性的变化与人类细胞表现相同，端粒酶在植物的营养器官 的活性低，而在生殖器官和组织培养的脱分化细胞中，则活性高 (et 1996； et 1996； et 1996)。 利用基因的敲除（ 术，将老鼠中的端粒酶基因去除 ( , 1997； 1998)，结果发现，去除端粒酶基因的老鼠每繁殖一代，其端粒 失 5鼠的前几代生长正常，但是，从第五代开始，雄性老鼠的精细胞出现异常，第六代雄性老鼠精细胞完全不育，且体重仅为正常老鼠的 20%， 雌鼠的育性比雄鼠延迟一代，但是都不能产生第 7 代老鼠。利用插入，破坏拟南芥的端粒酶基因 (et 2001)，使端粒酶基因失活，拟南芥每繁殖一代丢失 250 南芥突变体的前几代生长正常 ,但是从第六代开始 ,其叶片和叶序及其育性都发生异常 ,在异常生长的拟南芥中 ,发现大量染色体的融合，仅有个别的突变体可以繁殖到第九代，没有第十代突变体生存（ et 2003）。上述实验说明端粒酶在生物的衰老中具有重要作用。 1 1 2 植物衰老的物质代谢变 化 1 1 2 1 蛋白质 植物在衰老中既有新蛋白质的合成，也有原来蛋白质的增加和降低，但蛋白质的总体水平呈下降趋势。关于蛋白质的合成，已通过蛋白质合成抑制剂延缓衰老的实验得到证明。实验证实植物进入衰老时蛋白质发生降解， 1973 年在研究离体烟草叶片衰老中发现，蛋白质降解发生在衰老的早期，且持续 7 天左右。吴光南等（ 1987）在研究水稻叶片衰老与蛋白质水解酶的关系时发现：蛋白质的降解发生的时间要比叶绿素、 解的时间早，并认为蛋白质的降解是叶片衰老的基本特征。蛋白质降解的主要原因是蛋白酶基 因的表达及已存在的蛋白酶的激活（ ， 1990）。 在 1995 年发现衰老的玉米叶片中存在一种酶，类似蓖麻种子中的液泡蛋白酶，推测有一些蛋白酶在绿叶期就已经形成，以无活性的状态存在于液泡中，在衰老中被激活表达。目前已在拟南芥、玉米、油菜、大豆中克隆到多种编码降解蛋白质酶的基因： 中 码天冬氨酸蛋白酶，其余几种基因的编码产物类似于半胱氨酸蛋白酶， 因在种子萌发中也表达， 因产物在植 物的液泡中广泛存在，可能参与液泡蛋白的加工修饰， 码的产物还与木瓜蛋白酶的序列相似，衰老特异性很强。据此推测，这几类蛋白酶可能与细胞中物质的动员有关。蛋白酶水解蛋白质可产生大量的 这两种氨基酸，又是 N 素在植物体内运输的主要形式。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 13 1 1 2 2 核酸 植物衰老期间 水平相对稳定，而 水平显著下降，其中又以 18降为甚， 18降解直接引起核糖体小亚基的降解，使核糖体解体，蛋白质合成能力下降。 992 年观察到叶片衰老时 性水平呈上升趋势， （ 1993）在缺磷的拟南芥叶片中克隆到 3 个 在衰老