CRISPRCas9基因敲入试验步骤(三)donor载体构建载体构建.doc

CRISPRCas9基因敲入试验步骤（三）donor载体构建载体构建 1、质粒骨架的选择CRISPR/Cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种，Mammalian 、Bacteria 、Drosophila 、Plant、C. elegans 、Yeast 、Zebrafish 、Xenopus，根据质粒所携带的编辑基因的不同，可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、C2c2（可剪切RNA）。当然，还有一些筛选标记，如puro、GFP、RFP、mcherry、潮霉素等等，我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。这里故意还掉了一种，最具有争议的Ngago，本楼主也重复过这个试验，也和大多数重复的人一样，GFP验证试验时，看到荧光显著减弱（本人还特意构建了一种Ngago载体，效果比韩老师的效果好很多），但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低，非常遗憾自己想法太简单，以先入为主认为是切割而没有去验证；最终结果是刘东老师使用Ngago发现了有表型（斑马鱼的眼睛上有缺陷），这个就是很强的提示，需要去做下一步，尽管基因组上没有被切割，有表型，那势必会去看该基因表达的数据，最后才有这篇文章。刘东老师运气也很好，knock down 有表型，如果没表型，估计也会放弃。这里就说到这，有不懂的可以留言询问。具体分类在addgene上有，网址/crispr/。2、酶切位点的选择插入sgRNA的酶切位点，质粒基本为这两种，BsmbI和Bbsi，具体可以参见该质粒的protocol，后续的连接、转化、验证protocol里面有，我就不啰嗦了。哦还忘了一件事，使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱，非常方便，强烈推荐！以慢病毒载体V2为例具体说明3、同源臂的设计同源臂我们一般都是在切割位点的两端各选一段，长度大约1kb-2kb，效率还可以。当然了，有人也用40-100bp做了也做成功了，但基本原则是越长效率越高。1kb-2kb效率已经很高，所以这个最合适。有相关文献支持，自己Pubmed查看。4、启动子、目的基因及其终止子的扩增这里也没什么可说的，启动子在我们选择质粒的时候就决定了，当然我们还可以改造以提高sgRNA的表达效率，这个时候我们可以通过方法筛选出该物种的启动子，替换上去就ok了。目的基因的话，如果我们要做敲除，基本就是根据基因组，在外显子区域设计sgRNA序列，切割后以非同源性末端接合（Non-homologous end joining, NHEJ），造成变异而使该基因失去功能。当然还有一种修复方式，同源性重组（Homologous recombination，HR）同源性重组修复是利用细胞内的染色体两两对应的特性，若其中一条染色体上的DNA发生双股断裂，则另一条染色体上对应的DNA序列即可当作修复的模版来回复断裂前的序列，因此在某些条件下，同源性重组又称作基因转换（gene conversion）。该方法是用于敲入基因，这个同时，我们可以加入抑制NHEJ修复的酶，同时就会促进HR修复，提高重组插入效率。终止子的话，没什么特别，基本可以通用，SV40终止子、BGH终止子等。5、donor载体的连接及克隆测序donor载体的连接及克隆测序这个就是我们分子生物学学生的基本功了，就不叙述了。6、细胞转染及载体功能的验证细胞转染的话，参见说明书就好了，转染试剂有lipo2000（适合siRNA和DNA共