小鼠脑组织病理总结.ppt

小鼠脑组织病理实验总结 内容 石蜡切片的制作冰冻切片的制作免疫组化免疫荧光HE病理相关试剂配制注意事项 石蜡切片的制作 取材和固定 处死动物后或者灌注后立即切取组织块 并快速投入固定液中 脱水和透明 梯度酒精和二甲苯浸蜡和包埋 石蜡切片制作 切片贴片 捞片 展片保存 烤片 冰冻切片的制作 取材和固定 灌注后立即切取组织块 并快速投入固定液中 或者处死后直接冷冻 脱水和透明 梯度蔗糖包埋 OCT 3 聚乙烯醇 切片制作 切片贴片 直接贴固定 冰冻丙酮3 5分保存 20 C 灌注 0 5 戊巴比妥钠100mg Kg麻醉小鼠 5分钟左右小鼠麻醉好 仰卧位固定四肢 用酒精棉球擦胸腹部毛 前开皮肤暴露胸部肌肉层 剑突上成V型剪开胸廓 暴露心脏 剪掉右心耳 即视野下心脏上色暗红组织 与心尖处30 角刺入左心室 37 左右生理盐水约10ml缓慢注入 冲净血液止 换4 多聚甲醛溶液 4 预冷 10 20分钟 鼠僵硬为好 固定 4 多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切片的固定时间不同 几小时到一周 我曾用过2天 可以 冲水 固定的时间越长冲水时间越长 预防甲醛沉积 取脑 断头 剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨 从枕骨大孔处沿正中线剪开露骨 用镊子掰开露骨 暴露脑组织 用弯头镊将脑组织勾出 在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应脑区组织 厚3mm左右 脱水和透明 浸蜡 石蜡切片 75 80 85 90 95 2个 无水乙醇 2 中每个4小时 过夜 正丁醇1 2天 二甲苯 2个 20 30分钟 三个蜡 每个大于2小时 冰冻切片 固定后脱水用10 20 30 蔗糖 0 1MPBS溶 每个室温下4小时 过夜 OCT包埋 先在锡纸盒冻一层 在中间放组织 切面朝下 再用OCT将组织没过 尽量减少气泡 在液氮表面 保持小盒水平 待中心尚透明时取出 放于 80 C保存 切片 石蜡 冷水 温水 54 56 烤片 80 切好烤片后可以室温保存 冰冻 切片温度 18 20 直接贴切好于冰冻丙酮中固定5分后 20 保存 固定方法注意事项 1 组织块大小2cmx2cmx0 5cm2 组织标本应及时放入固定液中 切忌干涸3 组织固定后必须冲洗 除去多余的固定液4 一般固定剂温度以室温 某些病毒则须低温下处理 用丙酮 20度至 40度固定30分钟5 浓度采用10 中性甲醛或4 多聚甲醛6 固定液量是标本体积20倍7 固定时间不超过24小时 组化实验设计 1 对常规组织切片进行仔细观察 根据可提供形态学特点 选择最佳并能反映病变的组织标本2 列出免疫组化的指标3 进行预实验 设立阳性 阴性对照 4 找出抗体的最佳修复方法 稀释度 孵育温度及孵育时间5 每张切片应表明抗体名称 防止相互混淆 实验过程 70 考片一夜 二甲苯3个每个10分钟无水乙醇 95 90 85 80 每个10分钟 3 双氧水阻断室温10分钟 现配现用 抗体修复液 现配 400ml一次一个抗体盒 微波炉高火6 7分 冷却至室温 再修复一次冷却 PBS5分 3 擦片加一抗 4 过夜 第二日PBS5分 3 加二抗室温20分 PBS5分 3 DAB显色 水冲5 10分 苏木素1 3分 水冲10 15分 80 85 90 每个3分 95 2个 无水乙醇 2个 二甲苯 2个 每个5分 中性树胶封片 免疫荧光 PBS5分 3 5 BSA室温封闭1小时 加一抗 4 过夜或根据说明书时间 第二日PBS5分 3 加二抗37 孵育1小时 PBS5分 3 DAPI染色 PBS2分 丙三醇封片荧光显微镜下观察照相 HE 70 烤片一夜 二甲苯3个每个10分钟无水乙醇 95 90 85 80 每个5分钟 苏木素1 5分 水 盐酸酒精 水 0 5 氨水 水 95 酒精2分 0 5 醇溶伊红1秒 95 酒精30秒 95 酒精 无水乙醇 3个 每个2分 二甲苯 2个 每个2分钟 中性树胶封片 吹干 病理相关试剂配制 4 多聚甲醛 40g多聚甲醛粉末溶于500ml水 50 左右 黄枪头加一滴1M氢氧化钠至澄清 冷却至室温 与500ml0 2MPBS混合 滤纸过滤 0 2MPB 1000ml0 2M磷酸氢二钠810ml称57 996g0 2M磷酸二氢钠190ml称5 928g蔗糖 用0 1MPBS配制生理盐水 0 85 氯化钠溶液 阻断液 0 3 H2O2甲醇溶液 30 双氧水2ml加入甲醇定容至200ml 现用现配 修复液 400ml 柠檬酸0 16g柠檬酸钠1 18g苏木素 100g硫酸铝钾加热溶于