实验二过氧化氢酶Km值的测定(精)

教案首页第 2 次课 授课时间：2006年11月5日11月9日课程名称生物化学与分子生物学实验课年级2006专业、层次临床医学本科授课教师许成山职称助教课 型(大、小)小学时3授课题目（章、节）实验二 过氧化氢酶Km值的测定基本教材或主要参考书自编生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求：1、巩固酶促反应有关参数的知识，加深理解Km值的定义；2、学习Hanes作图法测定Km值的原理和方法；3、掌握滴定管的使用和滴定终点的判断。大体内容与时间安排，教学方法：1、Km值的定义及求Km值的作图方法（林-贝氏作图法和Hanes作图法） 5min2、过氧化氢酶Km值测定的原理 5min3、过氧化氢酶Km值测定的注意事项 10min4、学生做实验 100min教学方法：实验+示教教学重点、难点：重点：1、Hanes作图法求Km值2、过氧化氢酶Km值测定的原理3、滴定管的使用和滴定终点的判断难点：过氧化氢酶Km值测定的原理教研室审阅意见：教研室主任签名：年 月 日基本内容手段课堂设计和时间分配一、Km值的定义：二、Km值的作图方法（一）双倒数作图法（林贝氏作图法）（二）Hanes作图法三、过氧化氢酶Km值测定的原理四、实验操作五、注意事项六、实验结果七、学生做实验提问简图简图示范操作在实验过程中进行巡视，注意纠正学生的不规范操作1min当酶促反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度即为Km值；Km值是酶促反应的特征性常数。4min以1/S为横坐标，以1/V为纵坐标求Km值。S/V为横坐标，以S为纵坐标求Km值。5min1、H2O2在过氧化氢酶的作用下分解生成了H2O和O2；2、S=加入的H2O2的量；3、V=固定时间内反应掉的H2O2的量=加入H2O2的量剩余H2O2的量；4、剩余H2O2的量可通过KMnO4滴定测出：2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O1、只做第3步；2、表格下：将各瓶置于37水浴预热5min改为室温摇匀。10min1、加入1:1000稀释血清0.5ml/瓶后保温准5分钟；2、硫酸的浓度较大，小心不要溅出!3、作图应该用坐标纸，标明有关参数4、滴定操作：（1）使用滴定管前要先检查滴定管是否漏水或有堵塞；（2）滴定管使用前还要润洗（加KMnO4至刻度线24ml处；（3）使用时，不能左右推动活塞（要以环指顶住管壁，拇指、食指和中指控制流量；（4）加滴定液时，液面要稍高于0，尔后排除尖端气体；（5）读数时，视线要与液面凹陷最低点平行。列表计算出有关数据，在坐标纸上作图求出Km值。100min 小 结Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。复习思考题、作业题已知某种酶的Km值为0.05mmol/L，试问要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80%时底物浓度应是多少？下次课预 习