毕业论文 初稿.doc

学号：122060102010 届本科生毕业论文（设计）题 目：响应面法优化盾叶薯蓣内生菌SYt1发酵条件学院(系)：生命科学学院专业年级：生物工程061班学生姓名：杜成志指导教师：秦宝福 副教授完成日期：2010.06.12目 录摘 要11引言21.1关于薯蓣皂苷元21.1.1薯蓣皂苷元功能和应用21.1.2薯蓣皂苷元生产现状31.2产活性物质植物内生菌的研究进展31.2.1 内生菌概述31.2.2 内生菌的生物学作用41.2.3 内生菌产生物活性物质研究的意义和展望51.3响应面法在发酵条件优化中的应用51.4薯蓣皂苷元的含量测定方法概述61.5本项目的研究基础及意义72 材料与方法82.1试验材料82.1.1实验菌种82.1.2 试剂、仪器与设备82.2实验路线92.3试验方法92.3.1菌种活化92.3.2种子制备92.3.3摇瓶发酵体系92.3.4发酵液中薯蓣皂苷元的提取92.3.5薯蓣皂甙元的含量测定102.3.6实验设计103 结果与分析133.1 标准曲线的绘制133.2 预发酵试验143.3 单因子实验143.4 Plackett-Burmen 试验153.5最陡爬坡试验164 讨 论174.1硫酸根离子对皂素产量的影响174.2关于Plackett-Burman实验的失败184.3关于皂素的提取与测定184.4关于进一步优化的建议18参考文献19致 谢22响应面法优化盾叶薯蓣内生菌SYt1发酵条件响应面法优化盾叶薯蓣内生菌SYt1发酵条件作者：杜成志 指导教师：秦宝福(西北农林科技大学生命科学学院 陕西 杨凌 712100)摘 要：盾叶薯蓣内生菌SYt1可以合成薯蓣皂苷元。本实验采用单因子实验、Plackett-Burmen 设计、最陡爬坡实验和响应面实验相结合的方法以期对薯蓣内生菌SYt1合成皂素的发酵条件进行优化。通过单因子实验筛选出最适碳源为蔗糖，最适氮源蛋白胨。Plackett-Burmen实验表明蛋白胨、MgSO4和NaCl是影响皂素产量的重要因素。但是最陡爬坡试验结果异常，没有得到最优发酵条件。关键词：盾叶薯蓣；内生细菌；薯蓣皂苷元；响应面法；优化Optimization of Fermentation Conditions of Endogenntic Bacterium SYt1 from Dioscroes zingbiberensis using Response Surface MethodologyAuthor: Du Chengzhi Tutor: Qin Baofu（College of Life Science，Northwest A&F University，Yangling， Shanxi，712100）Abstract：Endogenntic bacterium SYt1 isolated from Dioscroes zingbiberensis can produce diosgenin . In this experiment，single-factor test combined with Plackett-Burmen design、the path of steepest accent experiment and response surface methodology was conducted to optimize the fermentation conditions to produce diosgenin by SYt1 . By single-factor test the optimum carbon source and nitrogen source confirmed as sucrose and peptone respectively. Plackett-Burmen experiment indicated that peptone、MgSO4 and NaCl were the significant factors that affect the yield of diosgenin. However,the datas of the path of steepest accent experiment were abnormal,and the optimum conditions had not been found.Keywords： Dioscroes zingiberensis;endogenetic bacterium;diosgenin;response surface methodology;optimization1.引言盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)，隶属于薯蓣科薯蓣属，为多年生草质缠绕藤本。以其根状茎入药，称为黄姜，为我国传统常用中药材。主要活性成分为薯蓣皂苷元(diosgenin)，因含量高，质量好，为合成肾上腺皮质激素类药物的重要原料1。全国皂素资源植物调查资料显示，盾叶薯蓣的皂甙元含量最高，平均为5.93%，单株最高含量为16.15% 2。 1.1关于薯蓣皂苷元薯蓣皂苷元(diosgenin)，化学名称为5异螺旋甾烯-3-醇，属于异螺旋甾烯烷的衍生物，分子式为C27H42O3，分子量为414.6。薯蓣皂苷元是白色轻质粉 末，无异嗅，纯品熔点195。分子结构如图13。薯蓣皂苷元是薯蓣皂苷(dioscin)的水解产物。薯蓣皂苷属于甾体皂苷，由甾体母核和糖结合在一起。在合适的条件下(加酸加热和酶解)可水解成薯蓣皂苷元4。1.1.1薯蓣皂苷元功能和应用传统中医学认为，盾叶薯蓣以根茎入药，其性味苷、苦、凉。主治胃气痛，跌打损伤，痈肿早期未破溃，蜂螫虫咬，同时具有治疗皮肤急性化脓性感染、软组织损伤、降血脂等功效，也有降低胆固醇、抗炎、抗肿瘤等药理作用5。另外，薯蓣还有抗炎、抑菌、平喘、降血脂等作用。盾叶薯蓣中所含的水溶性皂苷能增加冠脉血流量和营养心肌，改善末梢循环从而增加心肌血氧供应，它还能降低总胆固醇、甘油酸三脂胆固醇，提高高密度脂蛋白-胆固醇水平，对纠正脂质代谢紊乱，防治动脉粥样硬化起有益的作用，同时还发现它有降低全血及血浆粘度的作用6。薯蓣皂苷元以糖苷的形式广泛地存在于自然界的植物中，具有雌激素、降低胆固醇、止咳、怯痰、脱敏、恢复病变组织及刺激肝素细胞生长与胆汁分泌的作用，常被用作甾体抗炎药(如地塞米松等)、性激素(如黄体酮、睾酮等)、女用避孕药(如炔诺酮、炔雌醇等)的半合成原料7，是医药工业的重要原料。其本身还有肝脏保护8、抑制癌细胞增殖9、治疗骨质疏松、抗糖尿病和消炎10等功能。薯预皂苷元是合成多种甾体激素和甾体避孕药比较理想的前体11，其甾体结构加以改造，可以得到各种不同甾体激素类药物。它可以合成双烯醇酮醋酸酯、黄体酮、强的松、可的松系列以及催产素、避孕药等数千种中间体或药物12,除原有的抗肿瘤、抗炎、避孕用途外，还具有降血糖、降血脂、降胆固醇、镇痛、麻醉、杀虫、增强心脏收缩力、减慢心率、抗动脉硬化、改善微循环等作用13。随着薯蓣皂苷元的许多生物学活性逐渐被发现，特别是防治心脑血管疾病、抗肿瘤、免疫调节等作用引起了国际上的广泛关注。中科院成都研究所就是利用从黄山药中提取的薯蓣皂苷来制成“地奥心血康”，临床证明对心血管疾病有很好的疗效14；利用从盾叶薯苷的根状茎中提取的水溶性皂试制成的“盾叶冠心宁”对心血管疾病在临床证明也有很好的疗效15。1.1.2薯蓣皂苷元生产现状薯蓣皂苷元可以合成蛋白同化激素、皮质激素、性激素等三大类数千种甾体激素药物，医药界称其为“药用黄金”。 据报道，国外合成皮质激素药物所用的起始原料，有60%是薯蓣皂甙元；而我国甾体药物的生产，目前基本上全部以薯蓣皂甙元为原料16目前国内有众多厂家利用其生产甾体激素类药物和甾体口服避孕药，是药品生产中仅次于抗菌素的一个重要领域。我国薯蓣皂苷元生产规模不断扩大，随着医药工业的发展，薯蓣皂苷元的市场前景也日渐广阔15。目前我国薯蓣皂素的生产方法主要有两种17：采用Rothrok首创的直接酸水解法生产薯蓣皂素的工艺。把原料浸泡粉碎，加酸加热水解，然后用有机溶剂提取。自然发酵工艺。此工艺是将薯蓣原料浸湿，任其自然发酵，使淀粉分解，植物体疏松水解，然后从总物料中提取皂素，使皂素的提取率提高。但是近年来由于盾叶薯蓣开发速度的加快，刺激了对野生盾叶薯蓣的高速无节制利用，很多地方的掠夺式采挖，使野生资源逐渐枯竭。另外，由于在盾叶薯蓣种植过程中的循环种-挖，对山区脆弱的生态环境造成了严重的破坏，尤其是造成地表植被破坏而引起水土流失；长期人工种植造成薯蓣种质资源退化，其皂素含量不断降低18。另外在传统的皂素生产过程中，会产生大量废水。这些废水有机污染物浓度高、酸度高、色度高，处理难度极大。按照国家污染控制的有关要求，这些高污染企业必须进行废水治理，达到国家一级排放标准，否则自行关闭。特别是在湖北、陕西、河南等省盾叶薯蓣主产区，位于我国重点保护的水资源南水北调中线水源汉江上游地区，更加重了对皂素行业水污染控制的分量和紧迫性19，对水资源的威胁不容忽视。与此同时，皂素用量却逐年加大，对质量要求也不断提高。此时，薯蓣产业面临着发展的机遇也面临着巨大的挑战：一方面，皂素巨大的市场需求是发展薯蓣产业的大好时机，也有利提高当地农民收入和增加地方财政收入；另一方面，当前的种植模式及皂素生产行业对环境的破坏性影响又制约这一行业的长远发展。在这种情况下，我们必须转变发展的模式，一方面选育出高产、稳产的薯蓣新品种，采用科学的、规模化的种植方法，并采用环保的、高效的皂素生产工艺，；另一方面需探索新的生产皂素的途径。1.2 产活性物质植物内生菌的研究进展1.2.1 内生菌概述微生物和植物有着极为密切的相互关系，其中根瘤菌与豆科植物，菌根真菌与木本植物的共生关系已为人们所熟知。80年代以来，人们注意到内生菌与植物之间也存在共生关系。内生菌(endophyte)泛指一切生活在植物体内的腐生、寄生和共生的真菌、细菌、放线菌等微生物，包括那些在其生活史中的某一阶段表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌20。内生菌包括内生真菌和内生细菌。内生菌广泛分布于植物体根、茎、叶、花、果实和种子等器官组织的细胞或细胞间隙中，其种类、数量、分布定植都因植物种类不同而异。在植物体内，不同的内生菌占据不同的生态位，并相互作用，建立一种生态平衡21。其中一些是分离频率高、数量大的优势种，而另一些是分离频率低的稀有种。由于内生菌长期生活在植物体内微环境中，并与之协同进化，在演化过程中二者形成了互惠关系22。一方面植物为内生菌提供光合作用产物和矿物质，另一方面内生菌的代谢物能刺激宿主植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。内生菌不仅能够参与植物次生成分的合成，或对植物次生代谢产物进行转化，而且还能够独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物的重要来源。1.2.2 内生细菌的生物学作用一般认为，植物内生细菌作为植物微生态系统中的天然组成成分，它们的存在可能促进了寄主植物对环境的适应，加强了系统的生态平衡。虽然对细菌在植物组织内的生物学作用还缺乏了解，但是许多内生细菌己作为生物防治剂、植物促生制剂和固氮菌剂广泛应用于实验室、温室和大田。1.2.2.1 生防作用用内生细菌进行生物防治的原理，主要是利用内生细菌在植物体内产生的一些抗生素对病原菌的拮抗作用，有些内生细菌能产生杀菌蛋白，也能起到杀灭病原菌的作用；有些内生细菌能产生几丁质酶，可以裂解真菌性病原菌的细胞壁从而起到生防作用23。除了上面提到的特异性抗生物质外，内生细菌的生防作用还有非特异性的一方面，即内生细菌定殖在植物体内实际上是占据了植物体上的生态位点。由于位点和生存空间的限制，就阻止了病原菌的入侵和定殖24。内生细菌还可以与病原菌形成营养竞争的对抗关系，使病原菌因得不到正常的营养供给而消亡。1.2.2.2 促生作用感染内生细菌的植物一般具有比未感染内生细菌的植物生长快的特点。内生细菌能产生促植物生长物质如植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等,直接促进植物生长25。研究表明有些植物内生细菌能产生植物促生物质，如植物激素等，在这方面研究最多的是生长素，如从墨西哥分离的18株重氮营养醋杆菌(Acetobacter diazotrophicus) 都有产生生长素的能力，表明重氮营养醋杆菌在与植物相互作用过程中不仅能固氮，而且还可以通过生长素的调节作用影响植物的代谢，促进植物生长26。1.2.2.3 在非豆科植物中内生固氮作用研究表明，很多植物内生细菌可以从空气中吸收氮气，并将其固定为化合态氮。有效的发挥非豆科植物内生细菌的共生固氮作用，在一定程度上可以取代或减少化肥的使用。固氮内生细菌可划分为兼性和专性两种固氮内生细菌。前者在根表、根内以及土壤中均表现出活跃的生存状态；后者在根内、茎叶等部位中定殖，在植物体外存活困难。目前已从甘蔗、牧草、禾谷类植物(水稻、玉米、小麦、高梁等)等非豆科植物中分离到多种具有固氮作用的内生细菌，主要有:巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、重氮营养醋杆菌(Acetobacter diazot rophicus)、固氮弧菌(A. zoaFcus spp.)等27。1.2.3 内生菌产生物活性物质研究的意义和展望内生菌具有多种生物学功能，能产生多种生物活性物质，特别是在寻找新的抗菌抗癌物质、抗植物病虫害物质方面，植物内生菌为我们提供了一个新的生物资源。在农业方面，施用植物内生菌生产的抗菌剂、抗虫剂及生长素对植物病害起到了很好的防治及促生作用。这样既减少了化学农药对环境的影响，又保证了农产品的品质。在医药领域，能产生抗生素的内生菌为抗生素的生产提供了新的丰富资源，有望满足日益扩大的抗生素需求量并解决因滥用抗生素而造成的抗药性等问题28。尤其是植物内生菌能产生抗癌物质给恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。植物内生菌的研究正蓬勃地开展起来，但在研究和应用的过程中也显现出了如用于生物防治使周围环境及植物体的微生态环境都对内生菌的生长和作用的发挥存在影响，使防治效果不稳定；能产生有医疗作用的活性物质的内生菌往往培养成本高，活性物质产量低等一些问题。而且，目前植物内生菌的作用机理的研究也有待深化。植物内生菌相对来说开发较少、次生代谢产物丰富，合理开发利用植物内生菌资源，寻找新的活性代谢产物，将成为今后研究的重点29。正是基于这种考虑，本实验室从盾叶薯蓣中分离纯化得到了能产生薯蓣皂甙元的几株内生菌，其中以SYt1产皂甙最优。1.3 响应面法在发酵条件优化中的应用响应面法(RSM) 是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对函数响应面和等高线的分析,能够精确地研究各因子与响应值之间的关系,寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法30。它可用在描述单个试验变量对响应值的影响、确定试验变量之间的相互关系、描述所有试验变量对响应值的综合影响。RSM是一种适用性强的试验设计方法,不仅包括试验设计、建模、因子效应评估以及寻求因子水平最佳操作条件等功能,而且具有数据统计处理功能,显示出了其它试验方法如正交试验、因子试验、田口试验方法等所不具备的优点,该法不但具备试验次数少,周期短、精度高等优点31，而且可以建立连续变量曲面模型;同时,对影响试验指标的各因子水平及其交互作用进行优化和评价,可快速有效地确定多因子系统的最佳条件32-34。RSM已经在食品、医药、生物工程、农业、天然物提取等领域广泛的应用。利用微生物发酵生产各种有用代谢产物,其培养基成分种类繁多,各成分间的相互作用也错综复杂,因而,微生物培养基的优化工作就显得尤为重要。数学统计中的多种优化方法已开始广泛地应用于微生物发酵培养基的优化工作中,其中以响应面法的效果最为显著。响应面法优化培养基的试验设计步骤为: 利用Plackett-Burmen(PB)试验确定主要影响因素:PB设计法是一种两水平的试验设计方法。它试图用最少的试验次数达到使因素的主效果尽可能精确的估计,适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究35。最陡爬坡法确定主要影响因素的水平:为了建立有效的响应面拟合方程,用最陡爬坡法逼近影响因素的最佳值区域,它以试验值变化的梯度方向为爬坡方向,根据各因素效应值的大小确定变化步长,能快速、经济地逼近最佳值区域36 。BBD(Box-Behnken Design)或CCD(Central Composite Design) 设计进行试验分析:BBD 或CCD 方法确定试验点,通过统计分析软件,寻求最佳的试验条件以及因素间的交互作用。江英英等37采用PB设计对发酵生产-氨基丁酸(GABA)的培养基中相关影响因素的效应进行评价,并筛选出了有显著效应的葡萄糖、碳氮比、MnSO4浓度,然后用BBD设计及响应面分析确定了主要影响因素的最佳培养基条件,GABA的产量达到6.02g/L。比优化前的4.35g/L 提高了38%。Muralidhar R.V.38使用响应面法比较两种不同的碳源葡萄糖和橄榄油对胞外脂肪酶产量的影响。用来生产脂肪酶的介质组分通过中心组合设计(五因素五水平)进行优化。结果发现使用葡萄糖作碳源时脂肪酶的最大产率为17.30U/mL 。而使用橄榄油作碳源时脂肪酶的最大产量为47.25U/mL ,由此可以看出,含有橄榄油的基质更适合用来发酵生产酯肪酶(C. cylindracea lipase)。谭天伟等39采用PB设计、最陡爬坡试验设计与BBD设计相结合的响应面法对一株脂肪酶生产菌进行的培养基的优化，使其脂肪酶的产量由5000 U/mL提高到6230 U/mL。1.4薯蓣皂苷元的含量测定方法概述薯蓣皂苷元含量测定的方法有多种40。经典方法有: 重量法、比色法、库仑法和薄层扫描法；现代方法有：旋光法41、红外分光光度法、微量电位滴定法、库仑滴定法、棒状薄层色谱火焰离子检测法(TLC-FID)、气相色谱法42、高效(正相， 反相) 液相色谱法43以及毛细管气相色谱法等。经典的方法对仪器要求不高，但灵敏度低，分离效果差。由于此类皂苷的种类繁多， 在各种薯蓣植物中的含量不一，因此，经典的方法很难对薯蓣皂苷元准确测定。色谱的方法可以很好地排除相关物质的干扰，但由于薯蓣皂苷元沸点高，气相色谱条件要求苛刻，因此，不被普遍使用。目前反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和分光光度法应用更为广泛。用分光光度法测定盾叶薯蓣皂苷含量的一般方法是：先使薯蓣皂苷元溶解在某种有机溶剂中，然后采用一定的显色剂使薯蓣皂苷元显色，再用分光光度计在最大吸收峰处测定薯蓣皂苷元的吸光值，最后可由标准曲线查得一定的吸光值所对应的薯蓣皂苷元的含量。陈战国等44以石油醚溶解样品，以香草醛-高氯酸为显色剂，冰醋酸为溶剂，使薯蓣皂苷元显色，用分光光度计在波长为530nm处测定薯蓣皂苷元的含量。从黄姜中提取的薯蓣皂苷元不需分离可直接测定，在110020100mg/L范围内呈良好的线性关系。张玲等45采用浓硫酸反应使薯蓣皂苷元显色，用分光光度法在波长为410nm处对黄山药中薯蓣皂苷元的含量进行测定。试验结果表明：方法的线形范围为230g/mL(r=0.9996)，平均回收率为97.8%；最佳显色条件为：水浴温度50、反应时间40min、浓硫酸用量10mL。该方法适用于薯蓣皂苷元提取过程中的常规检测。王俊等46用用石油醚作为溶剂将皂苷元溶解，高氯酸作为显色剂25显色25min，于410nm波长处对穿山龙中薯蓣皂苷元的含量进行测定,测定结果与高效液相色谱法相近，方法的线性范围为3. 1221. 84g/mL ,适用于薯蓣皂苷元提取过程中的常规检测。马敬中等47依据甾体化合物的共同结构环戊烷多氢菲可以发生Liebermann Barcharad 反应，产生颜色这一原理，建立了一般的甾体化合物分光光度法。即以Liebermann-Barcharad试剂（乙酸酐与浓硫酸以19:1体积比混合冷却制成）为显色剂，氯仿为溶剂，在460nm处对薯蓣皂苷元含量进行分光光度法测定。试验结果表明，用氯仿作溶剂，乙酸酐-浓硫酸作显色剂的甾体化合物分光光度测定法由于显色条件温和, 非甾体化合物不干扰测定。此法显色不依赖甾体中特殊官能团, 应用范围较广泛。在0.77693.1mg/L浓度范围内测定准确度较好。董静洲等48对该方法在黄姜中甾体皂甙元进行了进一步都得研究，使该方法的实际应用性更强了。1.5 本项目的研究基础及意义综上所述，薯蓣皂苷元有着广泛的生物学作用和广阔的应用前景，但是天然植物中薯蓣皂甙元的含量较低，且分离提取的难度较大、费时、成本高并带来极大的环境问题，目前又面临种质资源的挑战，这在一定程度上限制了我国皂素产业进一步发展。相关研究表明，植物内生细菌可以产生与其宿主相同或相似的生理活性物质，而目前对薯蓣内生菌的国内外研究较少，尤其对其内生细菌发酵产薯蓣皂甙元的研究几乎处于空白状态。因此，为了上述问题我们将目光转向了盾叶薯蓣的内生菌的研究。本实验室从盾叶薯蓣中分离纯化得到了能产生薯蓣皂甙元的几株内生菌，其中以SYt1产皂甙最优，该工作由本校2002级毕业生张佩佩与2003级毕业生周影茹完成。邓云峰在徐虹老师的指导下对该菌进行了鉴定，其属于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。孙学广在李军超老师的指导下对其生长培养基进行了优化。为了提高该菌的皂素合成能力，在秦宝福老师的指导下，莫海波和金泗虎对该菌进行了诱变选育。实验将在以前的研究的基础之上，应用响应面法对盾叶薯蓣内生菌SYt1菌株产皂素的发酵条件进行优化，以期筛选出适宜的发酵条件，为以后的进一步研究提供一定的指导，并为以后用发酵法工业化生产薯蓣皂素提供了一定的依据。2 材料与方法2.1实验材料2.1.1实验菌种产皂苷元的盾叶薯蓣内生菌SYt1是在秦宝福老师的指导下，由本校2002级毕业生张佩佩与2003级生工毕业生周影茹分离得到，已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号：2334，分类命名：地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis ，菌种由秦宝福老师提供。2.1.2 试剂、仪器与设备2.1.2.1 主要仪器与设备：SW-CJ-2FD型 超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司DH6000B型 电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司CHA-S型 恒温振荡器 常州国华电器有限公司LDZX-40B型 压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂HH-S6型 电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器公司101-2AB型 电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司RE-52AA型 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂BL-220H型 电子天平 日本岛津制作所WFJ7200型 可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司2.1.2.2 主要试剂：牛肉膏 生化试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司蛋白胨 生化试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司酵母膏 生化试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司麦芽浸膏 生化试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司NH4NO3 分析纯 中国派尼化学试剂厂郑州(NH4)2 SO4 分析纯 天津市博迪化工有限公司MgSO4 分析纯 天津市博迪化工有限公司KH2PO4 分析纯 天津市博迪化工有限公司NaCl 分析纯 天津市博迪化工有限公司蔗糖 分析纯 天津市博迪化工有限公司三氯甲烷 分析纯 天津市博迪化工有限公司盐酸 分析纯 成都市科龙化工试剂厂硫酸 分析纯 西安三浦精细化工厂乙酸酐 分析纯 汕头市西陇化工有限公司120汽油 购于西北植物研究所化工厂皂素标准品 秦宝福老师提供2.2 实验路线保藏菌种菌种活化种子培养预发酵试验单因素试验P.B.试验结果验证最陡爬坡试验响应面试验2.3 实验方法2.3.1菌种活化活化培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，成分为: 牛肉膏3g；蛋白胨10g；食盐5g；琼脂18g；自来水定容至1L，调pH至7.0-7.2（121灭菌30min）。用平板划线法将保存的菌株接种到平板上，于28培养2d，选取长势良好的菌株作为实验用菌。2.3.2种子制备种子培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，成分为: 牛肉膏3g；蛋白胨10g；食盐5g；自来水定容至1L，调pH至7.0-7.2（121灭菌30min）。挑取两环已活化的菌接种于50mL种子培养基中，28，150rpm恒温振荡培养2d，选生长良好的作为种子。2.3.3摇瓶发酵体系按各实验设计要求将各种培养基按成分要求配置好，分装于250mL三角瓶中，每瓶装液量为50mL，于121灭菌30min，冷去后，按10%的接种量（实际接入5mL）将种子发酵液接入发酵培养液中，于实验设计中要求的条件下培养7d。2.3.4 发酵液中薯蓣皂苷元提取50将发酵后的培养液中加入10mL浓盐酸（按体积比 浓盐酸:发酵液=1:5加入），使其发酵液中盐酸浓度达2mol/L，于水浴锅内沸水水浴水解4h，冷却后加NaOH中和至pH呈中性为止。酸解后的发酵液中加入250mL120#汽油，置于索氏提取器中加热回流萃取4h。提取液冷却后用分液漏斗将发酵液与汽油层分离。用旋转蒸发器将汽油层进行浓缩，将浓缩液转入干净的培养皿内，使其挥发至干，用于薯蓣皂苷元含量的测定。2.3.5薯蓣皂苷元含量的测定分光光度法47,48 2.3.5.1标准曲线的绘制：精确称量薯蓣皂苷元标准品9.0mg，用少量氯仿溶解，然后用氯仿定容到50mL，得薯蓣皂苷元标准溶液，浓度为0.18mg/mL。分别准确吸取0.0mL，0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL，3.0mL，3.5mL,4.0mL于10mL的磨口具塞试管中，然后加入4mL Liebermann-Barcharad试剂（浓硫酸与乙酸酐按1:19的比例配制而成），用氯仿滴加至刻度，塞上磨口塞，摇匀，于50水浴中恒温60min，取出冷却至室温，用分光光度计在波长为460nm处测定其吸光值。其中未加薯蓣皂苷元标准品的作为空白对照。以薯蓣皂苷元的浓度（mg/L）为横坐标，以吸光值A为纵坐标绘制标准曲线。2.3.5.2 提取液中薯蓣皂苷元含量的测定：用氯仿将培养皿内挥发至干的薯蓣皂苷元粗提物溶解，将溶解液转入磨口具塞试管中，再用少量氯仿将培养皿冲洗两次，以保证粗提物中的薯蓣皂苷元完全被洗下，冲洗液同样转入磨口具塞试管。按上述方法测其吸光值。根据标准曲线计算出发酵液中皂苷元的含量。计算方法如下：（1）先由测得的样品吸光值y，根据标准曲线方程计算出10mL反应体系中薯蓣皂苷元的浓度x；（2）再将10mL反应体系中薯蓣皂苷元的浓度(x)转换成50mL发酵液中皂苷元的浓度C（mgL-1)：反应体系中皂苷元的浓度(mg/L)10mL发酵液体积50mL计算公式为：发酵液中皂苷元的浓度C（mg/L)=2.3.6试验设计2.3.6.1预发酵实验预发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，成分为: 牛肉膏3g；蛋白胨10g；食盐5g；琼脂18g；自来水定容至1L，调pH至7.0-7.2（121灭菌30min）。将种子发酵液接入预发酵培养基中，设2个平行试验，于28，150rpm恒温振荡培养7d。用分光光度法测量发酵内皂素的含量（见2.3.5），求其平均值作为优化的参照。2.3.6.2单因子试验设计最适氮源的确定出发培养基：蔗糖20g，酵母膏2g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO40.5g，NaCl3g，调pH至7.0-7.2，自来水定容至1L。分别以牛肉膏、麦芽浸膏、NH4NO3、(NH4)2 SO4代替蛋白胨为氮源，并以不加氮源的作为空白对照，培养基其他成分不变，以5%的接种量接入种子液，28下180rpm振荡培养7d 。用分光光度法测量发酵内皂素的含量。确定最适氮源。2.3.6.3 Plackett-Burmen 试验设计39,52Plackett-Burmen设计法是一种2水平的设计方法，用较少的实验次数使各因素的主效应得到尽可能精确的估计，在众多考察因素中快速筛选最重要的几个因素，以供进一步研究。通过碳源和氮源单因子实验,根据细菌生长所需营养要素的基本原则以及以前的经验，选用实验次数N=12的实验设计，对蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、NaCl、温度、pH、转速9个因素取2个水平（见表2）进行研究，其中高水平的量为低水平的1.5倍，另外2个虚拟变量用于估计误差，用Design Expert7.1.3软件进行Plackett-Burmen实验设计。（见表2）。根据表2进行发酵试验。实验数据用Design Expert7.1.3软件完成。表1 Plackett-Burmen 设计各因素水平Table 1 The level of all factors in Plackett-Burmen design代码名称低水平（-）高水平（+）X1蔗糖（g/L）2030X2蛋白胨（g/L）69X3酵母膏（g/L）23X4D1-11X5KH2PO4（g/L）11.5X6MgSO4（g/L）0.60.9X7NaCl（g/L）0.40.6X8D2-11X9温度（）2530X10pH68X11转速（rpm）120180注：D1、D2为空白，作为虚拟变量。表2 Plackett-Burmen 实验设计表Table 2 The design of Plackett-Burmen experiment试验号X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X111号209211.50.60.613061202号2093-11.50.90.6-12561803号2093110.60.412581804号3062-11.50.60.612581805号3093-110.60.6-13081206号2062-110.60.4-12561207号2062110.90.6-13081808号306311.50.60.4-13061809号309211.50.90.4-125812010号3092-110.90.4130618011号3063110.90.60125612012号2063-11.50.90.413081202.3.6.4最陡爬坡试验设计39,53从Plackett-Burman实验分析中可知蛋白胨、MgSO4、NaCl是影响发酵液中皂素产量的重要因子，故对这三个因素进行最陡爬坡实验。在最陡爬坡实验中蛋白胨、MgSO4、NaCl三因素按相应方向和适宜步长进行相应变化，具体实验设计见表3。其他因素取Plackett-Burman实验0水平（根据实际情况有少许变化），分别为：蔗糖，25 g/L；酵母膏2.5 g/L；KH2PO4，1.5 g/L；温度，28；pH，7.0；转速，150 rpm。根据表三进行试验，确定最大响应值的响应区域。表3 最陡爬坡实验设计表Table 2 The design of the path of steepest accent experiment蛋白胨（g/L）MgSO4（g/L）NaCl（g/L）原点（0）7.50.750.5原步长1.50.150.1坡度（系数）3.8639.2967.22相应值5.80-5.896.72新步长（）0.58-0.150.6707.50.750.50+18.080.601.170+28.660.451.840+39.420.302.520+49.820.153.190+510.4003.862.3.6.5响应面试验确定显著因素的最优水平响应面分析法是一种寻找多因子系统中最佳条件的数学统计方法，其中Box-Behnken和Box-Wilson中心组合设计是两种较常用的响应面分析法(RSA)。根据相应的实验设计进行实验后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程，最后在一定的水平范围内求出最佳值。通过通过最陡爬坡实验确定发酵培养基重要影响因子质量浓度范围后，以重要影响因子为自变量，以发酵液中皂素的产量为响应值，根据Box-Behnken中心组合设计原理，设计3水平的响应面分析实验，中心点设置3次重复。2.3.6.4验证实验在优化后的培养基中进行5组试验，测量发酵液中皂素的含量，与理论值和初始值相对比，检验实验结果与模型的吻合度及优化效果。3 结果与分析3.1标准曲线的绘制以Liebermann-Barcharad试剂为显色剂，对不同浓度的薯蓣皂甙元进行显色，于460nm处测其吸光值A，数据见表4表4 标准曲线测定数据Table 4 The measuring datas of standard curve薯蓣皂甙元浓度（mg/L）吸光值（A）00.00090.050180.101270.126360.195450.244540.307630.340720.409以薯蓣皂甙元浓度/mgL-1为横坐标，以吸光值A为纵坐标，得到标准曲线：图1. 分光光度法测定薯蓣皂苷元的标准曲线 Fig1. standard curve of diosgenin measured by spectrophotometry由图1可知，吸光值A与薯蓣皂甙元浓度的线性方程为：y=0.0056x -0.0014 其中y为吸光值，x为薯蓣皂甙元浓度（mg/L）。图中R2=0.9981，说明线性拟合的程度很好，因此该方程可以较准确地表示出吸光度A与薯蓣皂甙元浓度之间的关系。3.2 预发酵实验以牛肉膏蛋白胨培养基进行的两组预实验，实验结果见下表。表5. 预发酵试验结果Table 5 The results of advance fermentation test 试验号吸光值A发酵液中皂苷元浓度（mg/L）平均值（mg/L）10.54819.6218.8220.50318.01 由上表可知，以牛肉膏蛋白胨培养基进行发酵试验，发酵液中皂苷元的平均含量为18.82mg/L。以该含量为参照依据进行下面一系列优化试验。3.3 单因素实验分别以牛肉膏、麦芽浸膏、NH4NO3、(NH4)2 SO4、蛋白胨作为氮源，其他培养基成分不变，进行发酵，测其发酵液中皂苷元含量，结果见下表。表6. 不同氮源对皂苷元产量的影响Table 1.The effect of different nitrogen source on diosgenin yield氮源吸光值A发酵液中皂素浓度（mg/L）空白对照0.57620.60(NH4)2 SO40.57220.44NH4NO30.93533.42牛肉膏0.80928.92麦芽浸膏0.65823.51蛋白胨1.01436.22 由上表中的数据绘制出柱形图，如下所示：图2. 不同氮源对皂苷元产量的影响Fig1.The effect of different nitrogen source on diosgenin yield由上表及图可知，以蛋白胨为氮源发酵液中的皂苷元产量达到最大，可达36.22mg/L。另外，(NH4)2 SO4作为氮源时皂苷元产量低于空白对照，说明(NH4)2 SO4对皂苷元的合成有抑制作用。3.4 Plackett-Burmen 试验根据表2的Plackett-Burmen 实验设计表进行发酵试验，测量发酵液中的皂苷元含量，结果见表7表7 Plackett-Burmen 实验结果Table 7 The results of Plackett-Burmen experiment试验号吸光值A发酵液中皂素含量（mg/L）1号1.06938.232号0.94633.843号0.52518.804号0.81329.095号1.11839.986号0.49117.597号0.43915.738号0.37113.309号0.43315.5110号0.28010.0511号0.1415.0912号0.1686.05用Design Expert7.1.3软件对表7中的数据进行分析，通过逐步回归分析，获得该菌发酵合成皂素的多元一次回归方程：Y=-13.86-0.287X1+3.864X2-1.523X3+9.593X5-39.29X6+67.217X7 （方程1）方程中，Y表示发酵液中皂苷元浓度的预测值。方程的相关系数R2=0.908 224，表明皂素产量的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，可用该方程对皂素产量进行预测。用Design Expert7.1.3软件进行方差分析（ANOVA），结果见下表：表8 Plackett-Burmen 实验结果分析Table 8 The analysis of Plackett-Burmen experiment变异源平方和自由度均方F值P值（ProbF）显著性模型1462.8596243.80988.2142330.0177显著蔗糖24.7107124.71070.8325320.4034蛋白胨403.21611403.216113.584820.0142显著酵母膏6.96163316.9616330.2345450.6486KH2PO469.02403169.024032.3254990.1878MgSO4416.77651416.776514.041680.0133显著NaCl542.16961542.169618.266320.0079显著残差148.4069529.68138总和1611.26611由上表可知，回归模型的P 值为0.0177（P0.05），说明该模型显著，即该模型在被研究的整个回归区域拟合很好。在模型中考虑的各因素中蛋白胨、MgSO4、NaCl的P0.05，说明这三个因素对皂素的产量有重要影响。从方程1中可知，蛋白胨和NaCl的系数为正，MgSO4的系数为负，即增加蛋白胨、NaCl的用量，减少MgSO4的用量可以增加皂苷元的产量。3.5最陡爬坡试验从Plackett-Burman实验分析中可知蛋白胨、MgSO4、NaCl是影响发酵液中皂素产量的重要因子，对这三个因素进行最陡爬坡实验，实验数据见下表：表9 最陡爬坡试验实验结果Table 9 The results of steepest ascent试验号吸光值A发酵液中皂苷元产量（mg/L）00.89231.910+10.80628.840+20.64323.010+30.79428.410+40.79128.300+50.80428.76随着蛋白胨、MgSO4、NaCl三个因素沿着相应的方向按步长变化时，皂苷元的产量的变化趋势如下图：图3皂素产量随爬坡实验的变化趋势Fig3.The change trend of diosgenin yield in stee