从6例血友病患者分离的TT病毒基因克隆及序列测定(精).doc

从6例血友病患者分离的TT病毒基因克隆及序列测定【 摘要 】目的了解血友病人的输血传播病毒(TTV)基因型及其在个体内存在状况。 方法对6例血友病人血清中分离的TTV进行基因克隆，从每例病人的标本随机选多个克隆进行测序，比较其核苷酸和氨基酸序列。 结果除1例病人的5个克隆TTV DNA序列基本相同外，其余病人所测的TTV DNA克隆序列均不完全相同。根据同源性分析，该6例病人的TTV DNA主要可分为3组：G1a、G1b和G2基因型。 结论同一病人可混合感染不同TTV毒株。【 主题词 】输血传播病毒； 基因型； 血友病 Cloning and sequencing of transfusion transmittedviruses(TTV) isolated from 6 patientswith hemophiliaZHANG Shumin*, Anders Widell, ZHUANG Hui, et al.*National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P.R.China【 Abstract 】ObjectiveTo study genotypes and status TTV existence in patients with hemophilia. MethodTTV DNA isolated from sera of 6 hemophilic patients by polymerase chain reaction(PCR) were cloned using TA easy vector. 3-5 clones selected from each patient randomly were sequenced, and then compared with TTV DNA sequences in GenBank. ResultsFive of 6 patients have different sequences of TTV DNA clones, and only one patient has the same genotype of the virus. All the clones obtained from 6 patients can be divided into 3 groups:G1a,G1b and G2. ConclusionMixed infection of different TTV strains was found in patients with hemophilia.【 Subject words 】Transfusion transmitted virus; Genotype; Hemophilia TTV为3.7kb无包膜的单链DNA病毒，于1997年发现，最初曾认为与 非甲庚型肝炎有关1, 2。初步的研究显示，TTV分布极为广泛，尤其是多次受血的人群，其TTV感染率较高。为了解血友病患者感染TTV的基因型及其在个体内的存在状况，我们对6例血友病患者血清中分离的TTV进行了基因克隆和测序，现将结果报告如下。材料与方法 标本：6例血友病人血清标本（A、B、C、D、E、F）由瑞典马尔默总医院微生物学系提供。材料来源：DNA提取试剂盒购自德国QIAgen公司。Topo-TA克隆试剂盒购自Invitrogen公司。Taq酶为PE公司产品。引物及PCR扩增条件：引物参照TTV序列设计。P1(19001923)：5-ACAGACAGAGGAGAAGG CAACATG； P2(21852164)：5-CTGGCATTTTACCATTTCCAAA； P3(19151938)：5-GGCAACATGCTTTGGATAGACTGG。其中P1、P2为外引物，P2、P3为内引物。第一次与第二次循环条件相同：94 5min后，开始循环，94 1min 30s，60，1min 30s，72，1min 40s，35个循环后，72延伸5min，PCR扩增产物用4%凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。克隆及测序：PCR扩增产物经1%低熔点琼脂糖电泳，切下目的带，用QIAgen试剂盒纯化目的DNA。根据TA克隆质粒试剂盒说明，将纯化DNA直接克隆入TA质粒中，分别用PCR直接检测和提取DNA后EcoRI酶切筛选阳性克隆。阳性菌株接种于LB-氨苄（100g/ml）培养基中，37培养过夜。用QIAgen试剂盒提取质粒DNA后，用M13(reverse)CAGGAAACAGCTATGAC和M13(forward)GTAAAACGACGGCCAG进行双向测序(ABI 373全自动测序仪)。序列分析和比较：用Sequence Navigator和Factura分析测定序列，序列比较用Mult Alin和Blast软件完成。2TTV克隆氨基酸序列比较Fig 2. Comparison of the sequence of TTV aminoacid结果1. TTV检测：应用套式PCR对6例血友病人进行检测，扩增片段约270bp(1915bp2185bp)。扩增产物经检测与目的片段的相对分子质量相符，6例血友病人均为TTV DNA阳性。2.克隆及测序：6例病人均采用TA质粒克隆，每个病人随机选择数个克隆进行测序，并比较核苷酸和氨基酸序列，结果发现除C病人的5个克隆序列基本相同外，其余病人所测克隆均有不同（见1、2），提示同一病人存在不同病毒株的混合感染。1TTV克隆核苷酸序列比较Fig 1. Comparison of the sequcnce of the TTV clones根据所测序列的同源性分析，从该6例血友病人血清中分离的TTV主要可分为3组：即Gla、Glb和G2(见3)。对比中国株(AF079173)和日本株(AB008394)相应位置序列，发现中国株(AF079173)与日本株(AB008394)的同源性最高，F-3株序列与中国株和日本株同源性较高，但与其它TTV基因组的同源性较低。随机选择C-3和A-4株序列与GenBank中TTV序列比较，发现C-3与英国(AF072749)和巴西(AF081078)株同源性最高；A-4与德国株(AF060547)和另一日本株JaBD21同源性最高（见3）。3TTV基因序列分析Fig 3. Geno typing of the sequence of TTV clones讨论TT病毒主要经血传播。Simmonds等3报道，在血友病人中TTV感染率较高。本研究检测的6例血友病人，TTV DNA均为阳性。通过对此6例血友病人TTV DNA克隆、测序及氨基酸和核苷酸序列比较，发现6例病人中有5例为不同TTV毒株混合感染。在HCV的研究中发现，其混合感染以一种病毒株为主的形式存在，其它毒株处于次要地位。本研究对每例病人测定5个克隆的序列结果未显示以一种病毒株为主的现象。如果这种混合感染现象是暂时的，则说明混合感染可能与病人多次受血有关。但是，如果这种现象长期存在，则提示可能有不同株病毒共存的现象。Tanaka 等4将世界各地克隆的93株TT病毒的ORF1(1939nt2149nt)进行比较后，将TTV主要分为6型，即G1、G2、G3、G4、G5和G6，并建立了RFLP分型方法。本研究所克隆的病毒序列包含此段序列，经比较，发现所测序列主要由3种不同类型基因组成。根据Tanaka 等的分型，可分别归于G1a,G1b和G2型。一例序列(F-3)与中国和日本株具有较大的同源性，说明G1、G2型可能在世界范围内广泛存在4。作者单位：张庶民(中国药品生物制品检定所)李河民(中国药品生物制品检定所)张华远(中国药品生物制品检定所)祁自柏(中国药品生物制品检定所)庄辉(北京医科大学)Anders Widell(瑞典马尔默总医院)参考文献1Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in post-transfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 24(1):92-97.2Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research, 1998, 10:1-16.3Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products. L