微生物学实验基本操作与培训.ppt

微生物基本实验操作技能要领及注意事项 一 无菌操作 1 无菌概念 什么地方是有菌的 什么地方是无菌的 哪些地方要求基本无菌 哪些地方严格要求无菌 2 操作环境 实验室 接种箱 超净工作台 无菌工作室 3 工作范围 接种 转管 倒平板 梯度稀释 涂平板 平板划线 菌体 菌悬液 转移及其他需要无菌操作的实验环节 一 无菌操作 4 要领及注意事项 以实验室接种 转管为例 1 斜面 接种环拿法 2 火焰保护 3 接种环灭菌 4 接种环冷却及轻快接触斜面 5 棉塞的制作及处理 二 染色 制片 1 类型 分装片和涂片 2 操作步骤 以涂片为例 1 涂片 载玻片 滴加生理盐水 挑菌涂成薄膜 2 干燥 室温自然干燥 3 固定 菌面向上 火焰上过2 3次 4 染色 滴加染色液 美蓝 覆盖 2 3分钟 5 水洗 自来水冲洗 至基本无色 晾干 6 镜检 调节光源 低倍镜观察 高倍镜观察 油镜观察 二 染色 制片 4 要领及注意事项 1 生理盐水和菌体一定不能过多 2 菌膜不能过厚 最好细胞分布疏密相间 3 固定要到位 不能残留水 也不能固定过度 4 染色时间正确 一定要按规定计时 5 水洗时 水流不宜过急 6 镜检前片子一定要干燥无水 三 油镜头的使用 1 工作范围 观察细菌及相近大小的微生物 真核微生物的细胞器 2 使用特点 一定要用油 操作要求较高 三 油镜头的使用 3 要领及注意事项 1 所用装片 涂片上一定不能有水 2 先用低 高倍镜观察并选好视野 并将待观察目标调至视野正中心 3 注意保护镜头和片子 从侧面观察镜头进入油系 4 油镜头观察时 用微调调焦距 始终按镜 片分离方向用微调调焦距 5 调焦距速度一定要慢 避免焦躁 因为图象出现的焦距范围很小 6 注意光线的强弱 7 用擦镜纸蘸取溶剂 二甲苯 擦净镜头和装片 四 革兰氏染色 1 工作范围 细菌学中最重要的鉴别染色法之一 也可用于其他微生物的鉴别中 一般的微生物形态观察不必用革兰氏染色 2 基本步骤 1 初染 结晶紫染色 2 媒染 碘液媒染 3 脱色 乙醇脱色 4 复染 番红复染 四 革兰氏染色 3 要领及注意事项 1 菌种的菌龄 要选择生长旺盛期的典型菌体 2 制片 按单染色的基本要求操作 3 乙醇脱色时间是本实验成功与否的关键 注意衬以白背景 用95 乙醇滴洗至刚刚无紫色为止 约20 30秒 立即用水冲净乙醇 4 观察时 以分散开的细菌颜色为准 5 对未知菌进行革兰氏染色时 应选择两株形态不同 染色结果不同的已知菌和未知菌一起混合制片 染色 五 细菌 放线菌 酵母菌和霉菌的菌体形态的差别 1 细菌 放线菌是原核生物 酵母菌和霉菌是真核生物 大小不同 2 放线菌和霉菌是丝状菌 细菌和酵母菌是非丝状菌 3 霉菌有孢子柄 子实体等特化形态 放线菌没有 4 一定要注意提问 不要理解为菌落形态 六 用血球计数板计数微生物的数量 1 工作范围 此法计得的是死 活菌的总数 故称总菌计数法 2 基本步骤 1 稀释 将酵母菌悬液进行适当稀释 菌液不浓 可不必稀释 2 镜检计数室 在计数前 先对计数板的计数室进行镜检 若有污物 则进行清洗 3 加样品 盖上盖玻片 用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴一小滴 让其自行渗进计数室 不可有气泡 4 显微镜计数 五分钟后 先低倍镜找计数室 后高倍镜计数 一般以每小格5 10个菌体为宜 常选四角和中央五个中格计数 格线上菌体只数上线和左边线 芽大于母体一半方计 同法计另一室 5 清洗血球计数板 自来水冲洗 切勿用硬物洗刷 自行晾干 镜检 洗净为止 12 可编辑 六 用血球计数板计数微生物的数量 3 要领及注意事项 1 计数结果是微生物总数 含死 活菌 2 菌悬液要摇匀 3 计数格数和分布要合理 4 对压线 出芽等情况处理 5 菌悬液稀释要适当 不要过浓或过稀 6 光线要适中 尤其不要太强 否则找不到计数室 7 要先低倍镜 后高倍镜 七 微生物大小的测定 1 工作范围 原核微生物的测定一般要用油镜头 真核微生物的测定一般用高倍镜即可 测微尺多用来测定细菌和酵母菌 放线菌和霉菌较少 2 操作步骤1 目镜测微尺的标定 1 放置目镜测微尺 测微尺刻度朝下 2 放置镜台测微尺 测微尺刻度朝上 3 校正目镜测微尺 按低 高 油顺序 使两种测微尺某一区间的两对刻度线完全重合 按下式计算 两对重合线间镜台测微尺格数 10目镜测微尺每小格长度 um 两对重合线间目镜测微尺格数2 菌体大小的测定 换上装片 测出菌体长宽格数 算出菌体大小 3 取出目镜测微尺 将两种测微尺用擦镜纸擦净 入盒 七 微生物大小的测定 3 要领及注意事项 1 镜台测微尺刻度务必朝上 2 目镜测微尺刻度朝下 放于目镜与镜头之间 3 按低 高 油顺序校正目镜测微尺 4 两对刻度线要整格完全重合 5 镜台测微尺线条太粗时 可与线条的同边对齐 6 测细菌等原核微生物时 用油镜头要严格按油镜头的使用要求操作 要特别注意光线的强弱 7 对不到一格的数值的判断一定要尽量准确 不能马虎 8 对各类微生物的大小要心中有数 如计算的结果与理论值差距很大 要验算 八 斜面 平板 摇瓶的制作 1 工作范围 斜面 培养和保存菌种 平板 微生物分离 纯化和活菌计数 摇瓶 微生物液体培养 模拟发酵罐 2 操作步骤 1 按培养基配方称量各种药品 试剂 2 斜面和平板按要求称量琼脂 摇瓶不用琼脂 3 溶化 加入少于所需要的水量 用玻棒搅匀 在电热套上加热使其溶解 加入琼脂 加热 搅拌溶化 补充水分至所需的总体积 4 调pH 测pH值 用滴管向培养基中加入NaOH或HCl 边调边测 直至要求的pH范围 八 斜面 平板 摇瓶的制作 5 分装 将配制的培养基分装入试管和三角烧瓶 250ml 内 试管装1 4 6 加塞 在管 瓶 口塞上棉塞 既保证通气又可阻止外界微生物进入造成污染 摇瓶用八层纱布盖口 7 包扎8 灭菌9 搁置斜面 趁热将试管棉塞端搁在玻棒上 使斜面长度不超过试管长度的一半 倒平板 用无菌操作的方法将三角烧瓶中的培养基趁热倒入培养皿中 6 7个 100ml 10 无菌检查 将斜面37 恒温培养24 48小时 以检查灭菌是否彻底 八 斜面 平板 摇瓶的制作 3 要领及注意事项 1 各种药品 试剂的称量要注意精确性 2 微生物培养用培养基一般用自来水配制 3 斜面的琼脂溶化要彻底 4 调pH 除 自然 外 千万不要省略 5 分装培养基应用培养基分装器 移液管 玻璃漏斗 分装 不要使培养基沾在管 瓶 口上 6 倒平板时 注意避免烧 烫手 九 灭菌 1 操作步骤 1 通电 打开开关 观察指示灯 视状态添加水 2 放置灭菌物品 3 设定温度 时间 121 20min 通电加热 4 完全排净冷空气 关上排气阀 5 灭菌结束后 切断电源 使锅内温度自然降至压力为0 打开排气阀6 取出灭完菌的培养基 物品 自然冷却 排尽水 九 灭菌 2 要领及注意事项 1 一定要检查水位 2 温度和时间设置方法按说明书要求操作 3 排净冷空气是关键 要理解原理 4 应开盖蒸发一定时间后再取出灭完菌的培养基 物品 5 大胆 细心 注意安全 十 包扎 1 试管 若干试管一捆 棉塞外包一层牛皮纸 2 三角烧瓶 棉塞外包一层牛皮纸 以防冷凝水润湿棉塞 用绳子扎好 3 移液管 上口塞棉花 报纸包扎 4 培养皿 6