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本科毕业论文 题 目稻曲菌产色素缺陷性突变的生物学特性姓 名谢 巍学 号2008301200176专 业植物保护指导教师黄俊斌职 称教授中国武汉 二零一二 年 六 月分类号 密级华中农业大学本科毕业论文 稻曲菌产色素缺陷型突变体的生物学特性The biological characteristics of the rice aspergillosis production of the pigment deficient mutant学生姓名：谢巍学生学号：2008301200176学生专业：植物保护指导教师：黄俊斌 教授华中农业大学植物科学技术学院二一二年六月目 录摘要IAbstractIII1.前言21.1 稻曲病在我国的背景21.2实验原理22材料与方法32.1材料32.1.1菌株32.1.2培养基和相关试剂32.1.3限制性内切酶及其它酶类、试剂盒42.1.4载体、DNA分子量标记52.1.5抗生素52.1.6引物62.1.7供试水稻品种62.1.8盆钵及接种器规格62.2稻曲菌T-DNA插入体库的构建62.2.2稻曲菌分生孢子培养方法62.2.3农杆菌培养方法72.2.4 ATMT转化方法72.2.5转化子保存方法72.2.6转化子的色素缺陷型筛选82.3稻曲菌S-81的T-DNA侧翼序列克隆及序列分析82.3.1 基因组总DNA的提取82.3.2突变体基因组DNA的酶切产物连接及连接产物的回收92.3.3酶切92.3.4连接92.3.5反向PCR扩增92.3.6 目的片段的回收及连接112.3.7连接产物的转化112.3.8重组质粒的提取及PCR鉴定112.3.9 重组质粒的测序及克隆序列分析122.4转化子的致病力测定122.4.1水稻种植122.4.2接种体的制备122.4.3接种时期和方法122.4.4调查与统计123结果与分析143.1稻曲菌T-DNA插入体库的构建143.2稻曲菌T-DNA插入体库的检测143.3突变体菌株S-81 形态特征、菌丝生长速度及产孢量测定15163.4侧翼序列全长及相关分析17183.5突变体菌株S-81的致病性测定204、讨论22参 考 文 献24致 谢26摘要摘要水稻稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens(Cooke) Tak)引起的一种穗部病害。该病害在世界各水稻种植区均有不同程度的发生，并且在某些年份曾一度大发生。木藏良三(1991)首先报道白色稻曲球的发生，白化菌株稻曲球的表层和内层均为白色。国内王疏（1997）等首先报道发现白色稻曲球，PS培养基中产分孢量极少，厚垣孢子表面光滑，PS滤液对水稻根和芽有毒性，可以使水稻发病产生白色稻曲球，用酯酶同工酶和RAPD分析认为白化菌株具有独立于稻曲病菌新的分类地位。林逾凡（2009）报道白化菌在固体培养基(PSA)、液体培养基(PS)上均不产生任何类型的抱子。白化菌株的接种试验结果显示，突变后的菌株不能使水稻发病。白化菌株的ITS序列和正常菌株的同源性达到100%。说明这种白化菌株属于稻曲病病原菌。本研究利用ATMT遗传转化系统，以质粒pTFCM为转化体，利用潮霉素抗性筛选转化子，对稻曲病菌分生孢子进行了转化。构建了含1500多个的T-DNA插入突变体库。随机挑取10个转化子, 以稻曲菌野生型菌株HWD-2和质粒pTFCM为对照，提取基因组DNA 进行 PCR 检测，质粒pTFCM和10个样品均扩增出潮霉素磷酸转移酶基因片段，野生型稻曲病菌株HWD-2不能扩增到潮霉素磷酸转移酶基因片段。通过潮霉素筛选和PCR检测，可证明 T-DNA 已成功地插入到了稻曲病菌基因组中。目前已经对1500个转化子的菌落形态差异进行了比较，得到到11株产色素缺陷的白化菌株，分别为B-12，F-18，F-24，F-37，F-56，F-61，F-64，G-6，G-29，J-44和S-81。对产孢量进行测定，白化菌株S-81的产孢量达2.3106（个/ml），其他白化菌株几乎不产孢，野生型HWD-2产孢量达8.6106（个/ml）对生长速度进行测定，白化菌株S-81的生长速度为2.24mm/d，比野生型HWD-的生长速度快但差异不显著（P0.05）。对致病力进行测定，野生型菌株HWD-2能引起水稻发病，水稻穗部产生黄绿色的稻曲球，显微观察可见大量的黄色厚垣孢子，S-81也可以引起水稻发病，水稻穗部形成白色稻曲球，显微观察可见大量的白色厚垣孢子。采用反向PCR技术对白化菌株S-81中T-DNA插入位点的侧翼序列进行克隆，将扩增产物纯化后连接到pMD18-T载体上进行克隆测序分析，结果获得白化菌S-81的T-DNA的插入位点右侧的DNA片段。经过测序和将推定的氨基酸序列在NCBI上进行同源性比对发现，S-81的T-DNA侧翼序列和绿僵菌的起始识别复合物亚基（origin recognition complex subunit）的蛋白质序列同源性最高达到83%，E值为3e-171。 关键词：稻曲病菌；白化菌株；突变体;致病性IAbstractAbstractRice false smut disease is caused by virens (Ustilaginoidea virens (Cooke) Tak) in panicle. The disease causes in the rice growing areas of the world in varying degrees, and once in some years occurred. MU zang Liang san (1991) first reported the occurrence of the white curve ball of rice, the surface and the inner of the bleaching strains Ustilaginoidea ball is white. Domestic Wang Shu (1997) first reported the white rice curveball, spore production is sub-minimal on PS medium ,the surface of chlamydospore is smooth .PS filtrate is poisonous to rice roots and the disease produce white rice hook ball. albino strains is independent of the taxonomic status of virens including to esterase and RAPD analysis.Lin yu fan (2009) reported albino bacteria in solid medium (PSA)or a liquid medium (PS) shall not produce any type of spore. The albino strain inoculation test results show that the mutant strains can not make rice onset. ITS sequences of the albino strain and normal strain are in homology of 100%. It expresses this albino strain belongs to the false smut pathogen.Currently 1500 transformants colony morphology differences has been compared, we get 11 producing pigment deficient albino strains, respectively B-12, F-18, F-24, F-37, F-56, F-61, F-64, G-6, G-29, J-44and S-81. On sporulation quantity is measured, the albino strains S-81sporulation is up to 2.3x 106( /ml ), other albino strains hardly sporulating, wild type HWD-2 sporulation is up to 8.6x 106( /ml ) on the growth rate of albino strains, S-81growth rate is 2.24mm/d, faster than the wild type HWD- 2 but the difference was not significant ( P0.05). On the pathogenicity ,wild type strains HWD-2 can cause the onset of panicle rice, yellow green smut ball, microscopic observation showed a large amount of yellow chlamydospores, S-81can also cause disease in panicle rice, white rice ball, microscopic observation showed a large amount of white chlamydospore.Using reverse PCR technology on albino strains S-81T-DNA insertion site of the flanking sequences were cloned, will be amplified product was purified and connected to the pMD18-T vector was cloned and sequenced, the results obtained by S-81T-DNA albino insertion sites on the right side of the DNA fragment. After sequencing and the putative amino acid sequence homology comparison of NCBI, S-81and T-DNA flanking sequence of Metarhizium anisopliae origin recognition complex subunit ( origin recognition complex subunit ) protein sequence homology reached a maximum of 83%, E value for the3e-171.Key words: Rice false smut disease; Albino strain; mutant; pathogenicI2材料与方法1.前言1.1 稻曲病在我国的背景稻曲病是侵染水稻穗部的一种病害。20世纪80年代，该病害在我国局部小面积发生，至90年代，又大面积发生。稻曲菌白化菌株有多次报道，但其生物学特性各执一词。本研究通过T-DNA插入得到稻曲菌的突变体，并筛选得到产色素缺陷型的白化菌株。目前稻曲菌T-DNA插入突变体的白化菌株尚未见报道。稻曲菌白化型突变菌株的产孢、产毒素、致病性等生物学特性与野生型稻曲菌和自然界存在的白化稻曲菌是否有差异性还需进一步研究。1.2实验原理根癌农杆菌介导转化真菌（ATMT）是最近几年为人们所推崇的一种新型的转化方法。这种方法操作简单并且转化效率较高，另外也容易得到稳定的转化子。T-DNA和相关标记基因片段的插入，能够为已突变基因提供分子标记，为基因克隆等相关研究提供比较便利的条件。当下关于稻曲病的研究和报道许多都是关于侵染循环、生物学特性或是防治等方面。但是关于稻曲菌的分子遗传学的报道较少，其功能基因的研究更少。这些都使我们对认识稻曲病菌致病机制和产孢机制产生了阻碍。本研究通过稻曲菌T-DNA插入体库的构建，筛选色素缺陷型突变体。2材料与方法2.1材料2.1.1菌株稻曲菌菌株HWD-2:本实验室分离保存（对水稻的致病力强，分离于湖北武汉东湖新村），在PSA上培养（28）和滤纸片上保存（4）。农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105(Strr和Rifr)：Ti质粒的宿主菌，用于稻曲菌的转化。用LB液体培养基振荡培养（28），在含有15%甘油的LB培养液中保存（-80）。大肠杆菌（Escherichia coli ）：DH5a:克隆的宿主菌。用LB液体培养基振荡培养（37），在含15%甘油的LB培养液中保存（-80）。2.1.2培养基和相关试剂PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，1.5%的琼脂，加水至1000 ml。PSA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，1.5%的琼脂，加水至1000 ml。PS液体培养基：马铃薯200g，蒸馏水 1L，葡萄糖20g。LB培养基：蛋白胨10 g，酵母浸汁5 g，NaCl 10 g，pH7.0，加蒸馏水至1000 ml。加2%的琼脂。基本培养基（MM）：K-buffer（pH 7.0）0.8 ml，M-N 20 ml，1% CaCl22H2O(w/v) 1 ml，20%葡萄糖(w/v) 10 ml，20% NH4NO3 2.5 ml，补去离子水至1000 ml。使用前每毫升MM加0.1% FeSO4 1 l，50 mg/ml卡那霉素5 l。诱导培养基（IM）：1.25M K-buffer（pH 4.9） 8ml，M-N 20 ml，1% CaCl22H2O(w/v) 1 ml, 20%葡萄糖(w/v) 10 ml，20% NH4NO3 2.5 ml，50%甘油10 ml，补去离子水至1000 ml。使用前每毫升IM加0.1 FeSO4(w/v) 1 l，0.1 mol/l AS 4 l，100 mg/ml MES 10 l。共培养基（CO-IM）：同IM，但20葡萄糖(w/v)用量减半，在灭菌前加2%琼脂。CO-IM在使用之前每毫升加0.1 FeSO4(w/v) 1 l，0.1 mol/l AS 4 l，100 mg/ml MES 10 l。SOC培养基：Bacto-tryptone 20 g，Bacto-yeast extract 5 g，NaCl 0.5 g，溶解后加入10 ml 250 mmol/L KCl，补水至1000 ml，调至pH为 7.0，灭菌20 min，冷却后，加20ml无菌的1molL葡萄糖溶液，使用前加入5 ml 2 mol/L MgCl2。SOB培养基：Bacto-tryptone 20 g，Bacto-yeast extract 5 g（Oxoid公司），NaCl 0.5 g，完全溶解后加入10 ml 250 mmol/L KCl，pH 7.0，加水至1000 ml，灭菌20 min，使用前加入5 ml 2 mol/L MgCl2。SOC培养基：1 L SOB加20 ml 1 mol/L葡萄糖。M-N母液: 含30 g/L MgSO4.7H2O和15 g/L NaCl ，灭菌备用。AS（乙酰丁香酮）：称取196.2 mg乙酰丁香酮，用二甲亚砜（DMSO)溶解，定容到10 ml，即得到浓度为0.1M的乙酰丁香酮溶液，不用灭菌。MES:脂肪酸甲酯磺酸盐。质粒提取溶液按分子克隆实验指南配制，其中：溶液I：10 mmol/L EDTA，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L 葡萄糖；溶液II：0.2 mol/L NaOH，1% SDS；溶液III：29.442 g KAc，11.5 ml冰醋酸，定容至100 ml。TE：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，供DNA的溶解及保存。使用时添加RNase A至终浓度为20 ng/ml。电泳缓冲液10TBE：Tris 108 g，硼酸55 g，0.5 mol/L EDTA 40 ml，加水至1000 ml，工作浓度为0.5TBE。10% SDS：50 g SDS加入400 ml水中，微波炉加热溶解，定容至500 ml，无需灭菌。DNA抽提缓冲液：2% CTAB，2% PVP，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl。细胞裂解液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0），50 mmol/L EDTA，3% SDS，1%巯基乙醇。其它各种化学试剂为国产化学分析纯。2.1.3限制性内切酶及其它酶类、试剂盒T4 DNA连接酶、限制性内切酶、耐热性DNA聚合酶、Taq DNA 聚合酶：LA Taq DNA Polymerase均为宝生物公司（TaKaRa，大连，中国）产品。DNA 凝胶回收试剂盒：AxyPrepTM，Axygen Biosciences, Inc，USA； 2.1.4载体、DNA分子量标记DL2,000TM DNA Marker （M1），分子量标准从上至下依次为： 2,000 bp、1,000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp（TaKaRa，Dalian，目录号：D501A）。双元载体pTFCM（Kanr，含PtrpC：hphB）（如图1），华中农业大学姜道宏教授惠赠。图1 用于转化稻曲菌分生孢子的pTFCM 载体Fig1The vector of pTFCM for transformation of Ustilaginoidea virens2.1.5抗生素潮霉素（50 mg/ml）：Roche公司产品卡那霉素（10mg/ml）：100mg卡那霉素，用10ml无菌的去离子水溶解后，用细菌过滤器过滤，用1.5ml的EP管分装于-20贮存备用。（Gibco公司产品）链霉素（100mg/ml)1000mg链霉素，用10ml无菌的去离子水溶解后，用细菌过滤器过滤，用1.5ml的EP管分装于-20贮存备用。（Gibco公司产品）头孢霉素（100mg/ml）：1000mg头孢霉素，用10ml无菌的去离子水溶解后，用细菌过滤器过滤，用1.5ml的EP管分装于-20贮存备用。（Gibco公司产品）氨苄青霉素（50mg/ml）：50mg氨苄青霉素，用1ml的无菌的去离子水溶解，用细菌过滤器过滤后于-20贮存备用。（Ameresco公司产品）利福平（10mg/ml）:用1ml无水乙醇溶解10mg利福平，浓度为10mg/ml ，于-20贮存备用。（Ameresco公司产品）2.1.6引物PCR引物是根据双元载体pTFCM上潮霉素磷酸转移酶基因hph序列设计的特异引物，用以验证转化子。序列如下：FP：5- CAGCGTCTCCGACCTGAT-3 ；RP：5- TCTGCGGGCGATTTGT -3反向引物：（a）左侧引物设计如下：外引物： Pttrpc: 5 ATGTCCTCGTTCCTGTCTGCTAATA 3LB-1: 5 AGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG 3内引物： Pttrpc: 5 ATGTCCTCGTTCCTGTCTGCTAATA 3LB-3: 5 GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT 3（b）右侧引物设计如下：外引物： RBGUS02: 5 TGCTCTAGCATTCGCCATTCAGG 3RB-1: 5 GATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTG 3内引物： RBGUS02: 5 TGCTCTAGCATTCGCCATTCAGG 3RB-3: 5 GCGCAAACTAGGATAAATTATC 32.1.7供试水稻品种粤优938。2.1.8盆钵及接种器规格长方体塑料盆：规格为35cm27cm12cm。接种器：体积为10mL的一次性医用注射器。2.2稻曲菌T-DNA插入体库的构建2.2.2稻曲菌分生孢子培养方法挑取新鲜的稻曲菌菌株HWT-2菌丝块于50ml PS液体培养基中, 28下170r/min摇床振荡培养8d，用灭菌三层纱布过滤培养物获得薄壁分生孢子，用无菌水稀释至孢子浓度为5106/ml左右备用。2.2.3农杆菌培养方法将含重组质粒pTFCM的农杆菌菌株在LB培养基上（卡那霉素、链霉素和利福平浓度均为50 g/ml）进行画线分离，在28下培养3d，挑取分布稀散的单菌落在LB液体培养基（卡那霉素、链霉素、利福平浓度均为50 ug/ml）中，在28 200 r/min 的摇床内培养24 h。取农杆菌菌液150l于含50g/ml卡那霉素的50ml MM培养基，摇床200r/min，28培养1d，再用含有78.48g/ml AS和1 mg/ml MES的IM培养基摇菌培养200 r/min，28培养12h，测量菌液OD600值，调节菌液OD600为0.5左右。2.2.4 ATMT转化方法将200 l的农杆菌菌液（OD600值为0.3）和200 l稻曲菌孢子悬浮液（106个/ml）制成混合液，将混合液在摇床中摇2-3h，并制备Co-IM（含78.48g/ml AS和1 mg/ml MES）培养基平板，将灭菌过后的玻璃纸平铺在Co-IM培养基平板上，取200ul上述混合液用刮铲涂匀于玻璃纸上，放在23培养箱中培养3d。等菌丝长出后，在无菌操作台上将玻璃纸揭起并平放于新的灭菌培养皿中（长菌丝的一面朝上）在上面倒入冷却到常温的PDA培养基（含有30g/ml潮霉素和500g/ml的头孢霉素），轻轻摇匀，使其能完全覆盖玻璃纸，置于23培养箱中培养4d，后挑取PDA培养基表面上长出的单菌落，将挑取的单菌落转入含30g/ml潮霉素、500g/ml的头孢霉素PDA平板上培养。继代培养可以在不含抗生素的PDA平板上，转五代后获得稳定的转化子并保存。2.2.5转化子保存方法用打孔器在转化子边缘的菌丝块打孔，转接到新的PDA平板中央。将剪成0.5cm左右的无菌滤纸圆片铺在菌丝块的周围，放置于28培养箱中，培养7d左右，等到菌丝长到纸片上后，把滤纸圆片揭下，放入无菌的干硫酸纸袋中，编号保存。将装有滤纸片的硫酸纸袋放入干燥器中，干燥48-72h后，收集编号置于20冰箱长期保存。2.2.6转化子的色素缺陷型筛选 转化子产孢能力比较将转化子活化后，用打孔器（5mm）打取菌落边缘菌丝块，菌丝面朝下接种到新的PDA平板（=9cm），每个菌株重复5次，置于25培养七天后，并在每个培养皿加2ml蒸馏水，用刮铲洗孢子，用两层擦镜纸过滤至2ml的离心管中，5000rpm离心5min后，弃上清，定容至2ml，镜检孢子数量。S-81的产孢量达2.3106（个/ml）HWD-2的产孢量达8.6106（个/ml）。突变体菌株S-81的菌丝生长速度测定用PSA活化保存的突变体菌株S-81，用打孔器（5 mm）打取菌落边缘生长旺盛的菌丝块，有菌丝的一面朝下，接种于含20 ml PSA的中型培养皿（90 mm）中。以野生型菌株HWT-2为对照，每个菌株5个重复。于28恒温光照培养箱中培养，观察菌落形态。培养第三天起，每24 h采用十字交叉法测量一次菌落直径，计算菌丝的生长速度，并用SAS8.0分析差异显著性。本实验重复3次。生长速度（mm/d）=（第15天菌落直径第1天菌落直径）422.3稻曲菌S-81的T-DNA侧翼序列克隆及序列分析2.3.1 基因组总DNA的提取在已经制好冷却的PDA平板上铺一层无菌玻璃纸，将活化的稻曲菌S-81菌丝块接种于玻璃纸上，每皿9块。在20培养23 d，收集菌丝，置于-80冷冻保存。真菌总DNA的提取，参考分子克隆指南，具体步骤如下：（1）称取0.2 g 于-80冷冻的真菌菌丝在液氮中充分研磨成粉末，转入1 ml 65预热的抽提缓冲液，颠倒混匀。（2）65温育5 min，中间轻轻混匀两次。（3）加入等体积氯仿苯酚（v/v = 1/1）混匀，12,000 rpm离心15 min；取上清，再加入等体积氯仿苯酚（v/v = 1/1）再抽提一次；取上清，加入等体积氯仿再抽提一次。（4）取上清，加入两倍体积的-20预冷的无水乙醇，室温下静置30 min。（5）12,000 rpm离心10 min，弃上清，再用-20预冷的70%乙醇洗涤两遍。（6）置37温箱干燥10 min，用30 l TE溶解，得到真菌的总DNA。（7）取3l 用于电泳检测结果，其余置于-20保存备用。2.3.2突变体基因组DNA的酶切产物连接及连接产物的回收2.3.3酶切使用限制性内切酶Kpn和Sac。将反应体系置于37温度下反应12h以上。反应结束后，取5 l电泳检测酶切结果。若酶切效果好，则将产物于65下温浴1小时，使内切酶失活。酶切反应体系如下:10L Buffer10 l内切酶1.5 lDNA1.5-2.0gddH2O补足至100l 2.3.4连接使用T4-DNA连接酶连接酶切产物，连接过夜，16。连接反应体系如下： 10T4 DNA Ligase Buffer15 lT4 DNA Ligase0.5lDNA（酶切产物）0.5 lddH2O134 l将连接产物加水至500ul，用等体积的苯酚和氯仿抽提1-2次，加0.6倍体积的异丙醇和0.1倍体积的3 M 醋酸钠常温静置30 min，12,000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀。用预冷的70% 乙醇洗两次，37干燥后，加10-15l ddH2O溶解10 min。-20保存，用于以下的反向PCR扩增。2.3.5反向PCR扩增反向PCR用于扩增一段已知序列旁侧的未知的DNA序列，本实验采用反向PCR技术对T-DNA两侧序列进行扩增。根据Inverse-PCR的引物设计原则，在T-DNA序列上设计引物。以限制性内切酶Kpn为例，策略如下图。图2 Inverse-PCR克隆T-DNA插入位点侧翼序列的策略Fig 2 Inverse-PCR strategy for cloning the sequences on both sides of genes gDNA扩增反应体系一般为25ul:10Buffer2.5 ldNTP1.5ul引物11 l引物21 lTag酶0.2ulDNA1ulddH2O17.8l PCR扩增为巢式PCR（nested-PCR），左侧第一次PCR：以Pttrpc & LB-1为引物进行第一次PCR。将一扩产物稀释50倍，用于第二次扩增。第二次PCR：以Pttrpc & LB-3为引物进行第二次PCR，扩增反应体系同第一次PCR。右侧第一次PCR：以RBGUS02& RB-1为引物进行第一次PCR。将一扩产物稀释50倍，用于第二次扩增。第二次PCR：以RBGUS02 & RB-3为引物进行第二次PCR，扩增反应体系同第一次PCR。PCR反应程序：94 5min，94 30s，55 40s，72 50s，35个循环，72 10min。2.3.6 目的片段的回收及连接扩大反应体系至200ul，将第二次PCR获得的产物经1.0琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色20-30 min，分离并回收目标片段。目标片段的回收使用的是DNA 凝胶回收试剂盒，具体方法参考试剂盒说明书。将回收纯化的DNA和克隆载体pMD18-T相连接，操作必须在冰上进行。连接体系如下： 4.5 ulDNA，0.5 ul载体pMD18-T，5 ul Solution，16水浴连接过夜。2.3.7连接产物的转化质粒的热击转化方法参照分子克隆实验指南，具体步骤如下：（1）从-80冰箱取装有100 l菌株JM109感受态细胞的Eppendorf管置于冰上，融化23 min。（2）待其融化后加入10 l连接产物，轻轻混匀，在冰中放置2030 min。（3）42（精确）水浴70 s，再迅速转入冰上放置25 min。（4）冷却后在无菌工作台中加入到1 ml SOC培养液中（37预热），混匀后，37 150 rpm振荡培养1 h。（5）取500 l菌悬液均匀涂在含50 g/ml Amp的LB平板上，吹干。（6）37下静置培养12 h以上。大肠杆菌感受态细胞的制备方法参照分子克隆实验指南，具体步骤如下：（1）挑取大肠杆菌JM109单菌落至50 ml LB液体培养基中，37 200 rpm振荡培养8 h。（2）取500 l上述菌液于50 ml LB液体培养基中，37 200 rpm振荡培养23 h。当OD600达到0.40.5时，迅速将其移入冰水混合物中放置10 min，使培养物冷却至0。（3）在无菌工作台中将菌液倒入40 ml离心管中，4下3,0005,000 rpm离心5 min；弃上清液，加入10 ml预冷的缓冲液（0.1 mol/L CaCl2，0.01 mol/L Tris（pH 7.0），10 mmol/L DTT），重新悬浮沉淀，在冰水中放置20 min。（4）3,0005,000 rpm离心5 min，弃去上清液，用1 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重新悬浮沉淀，在冰水混合物中放置25h后即可使用。或在放置25h后加入甘油使其终浓度为1520，在冰水上放置1618 h后分装成每管100 l，-80保存。2.3.8重组质粒的提取及PCR鉴定采用碱裂解法提取质粒。重组质粒的PCR鉴定：以摇好的菌液为模板进行PCR扩增并进行电泳，检测扩增产物片段大小是否与目的片段大小一致，判断阳性克隆。进行PCR扩增的引物是根据pMD18-T载体序列设计的特异引物RV-M： 5GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3M13-47：5 GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCTG 32.3.9 重组质粒的测序及克隆序列分析将PCR鉴定的阳性克隆对应菌液送去测序公司测序，由上海桑尼公司完成。将测序得到的序列进行拼接，序列在NCBI（）数据库里进行blastx同源性搜索与分析。再利用Softberry软件（）进行了阅读框（ORF）预测，将推定的氨基酸序列在NCBI上进行同源性比较（blsatp）。2.4转化子的致病力测定2.4.1水稻种植将水稻种子用0.2%高锰酸钾消毒24小时后浸种两天，播种于规格为35cm27cm12cm的塑料盆中，每盆4穴，共20盆。2.4.2接种体的制备挑取新鲜的突变体菌株S-81及野生型菌株HWT-2菌丝块于盛有30ml PS液体培养基的三角瓶中，28、200r/min振荡培养8d。用三层无菌纱布过滤野生型菌株HWT-2的培养物获得薄壁分生孢子，用PS液体培养基稀释孢子浓度到106个/mL备用。2.4.3接种时期和方法中稻在水稻孕穗期接种，用10ml注射器将孢子液或孢子菌丝混合液注射2ml到水稻穗苞内，每品种接种3060株。以接种PS的水稻植株作对照。接种后，25条件下90%左右保湿3d，移至室外自然条件下，浇水保持湿度。2.4.4调查与统计水稻蜡熟期进行病害调查，记载发病穗数，统计发病率。113结果与分析3结果与分析3.1稻曲菌T-DNA插入体库的构建使用根癌农杆菌介导转化法，共获得稻曲菌T-DNA插入突变体1500余个。图3：在含有200ug/ml潮霉素的PSA上6d后的菌落。红色箭头代表transformant ；绿色箭头代表wild type3.2稻曲菌T-DNA插入体库的检测随机选取8个转化子，采用CTAB法提取DNA， 用FP、RP引物进行PCR扩增。目标片段约为1000bp，转化子和重组质粒pTFCM在1000bp处均有一条明显的条带，而出发菌株HWD-2没有扩增出条带（如下图），初步证明T-DNA已经插入稻曲菌株的基因组中。图4：稻曲病菌转化子的PCR检测。M: DL2,000TM DNA Marker; wt: 野生型菌株 HWD-2; 1-8: 转化子; pd: 质粒 pTFCM 。Fig4:PCR identification of HWD-2 and transformantsM: DL2,000TM DNA Marker; wt: wild type HWD-2;lane1-8, product of PCR amplification of transformants ;pd: product of PCR amplification of pTFCM.3.3突变体菌株S-81 形态特征、菌丝生长速度及产孢量测定病原菌在PSA人工培养基上生长比较缓慢，7天后才长成肉眼可见的菌落。典型的稻曲病菌落前期是呈白色凸起状，然后菌落表面逐渐转成黄色。突变体S-81在PSA上菌落颜色一直呈白色。图5为 PSA上培养15d后突变体菌株S-81和野生型菌株HWD-2的菌落形态。由图可见，野生型菌株HWD-2在PSA上培养15d后形成黄色圆形菌落，突变体菌株S-81形成的菌落规则呈白色。ab图5：突变体S-81和野生型菌株HWD-2的菌落形态a;菌落正面：红箭头代表野生型，绿色箭头代表菌株S-81.b;菌落反面：红箭头代表野生型，绿色箭头代表菌株G-29c在28恒温条件下培养，在PSA上突变体菌株S-81菌丝生长速度为2.24mm/d，比野生型菌株HWD-2生长速度快，但差异不显著（P0.05）（见表1）。生长速率mm/d Growth rate 菌 落 直 径 /mmColony diameter 2.24a33.5636.831.530.632.436.5S-812. 03 a30.432.528.023.533.534.5HWD-2平均值Average 重复5Repeat 5重复4Repeat 4重复3Repeat 3重复2Repeat 2 重复1Repeat 1 菌株号Strain表1：稻曲病菌菌丝生长速度对产孢量进行测定，白化菌株S-81的产孢量达2.3106（个/ml），其他白化菌株几乎不产孢（无法计算），野生型HWD-2产孢量达8.6106（个/ml）。突变体S-81与野生型HWD-2比较产孢量下降。（见图6）图6：突变体S-81与野生型HWD-2菌株产孢量比较Figure 6: comparison of mutant S-81 and wild-type HWD-2 strains sporulation3.4侧翼序列全长及相关分析用Kpn1对突变体S-81基因组进行酶切（见图7）。采用Inverse-PCR技术扩增T-DNA插入位点进行扩增，得到T-DNA的右侧序列，产物电泳结果如图8。图7：S-81用内切酶kpn1处理后效果 图 8 Inverse-PCR扩增T-DNA插入位点的右侧序列M: DL2,000TM DNA Marker;1:一扩产物;2:二扩产物。Fig 8 Inverse-PCR amplification of the right sequences of T-DNAM: DL2,000TM DNA Marker; 1: the first round PCR amplification product;2: the second round PCR amplification product。通过反向PCR扩增和序列拼接，得到T-DNA插入位点的侧翼序列，结果如下（灰色部分为T-DNA右边界的序列）：1 CGCGCGGTGT CATCTATGTT ACTAGATCGG GAATTAAACT ATCAGTGTTT TCGAGCCGAC61 TCGCTAGTCT GCAATCTGCA TAAGATGTCC AATGGCACAT GTAGTCGGCC GTAATCTCCG121 ATGTCTGTTC CTCTGTCCAC ACCGACAATC TGCTAACTAA CCATTGATCT TCACGACGAG181 CCCGAATAGA ACCCAGCTCT GTCCACCCCC ATATTTGCTT CTGAGCCCAT GAGAAACAAA241 CTGAAACTAG TCCTAAGCGC CCTTTGCCAT GTCTCCATAC CTGCATTGCC GACAACGTAA301 TAATTAATAG CAATAATAAT AACAACAATA ACAACAACAA CAACAACAAC AATAATGGCT361 CGAGTTGTAT CACACACGTC CATCAAGATT CTTGAACCTC AATCACGGCG TCTTCTCCCA421 CCCACATTTC TCTCCCACAC TGTCATGTGT CCTGTTGGCC AGAAACCCAG CTCTTCTGCA481 CGTCTTTCCA ATTTGCGTCA TCAAACCGAC GCCTAGAGCC ACTTGATCTT GGCTATGTGA541 TCAATCTTCT TCTTGCTGGC CTTGACAAAT CCCAAAGCCC TCATTTCGGC AAGACCACGA601 TAGAACAGGA CCAATGTCCT GCGCTCGTCT TCCCCCCCCT GGCTCACCAG CGCGCGGAAA661 GCTGTCCATA AATCCGCAAC GTTGACCAGA TTTCCAGCCT CTAGGTACAG TTGATAAAGA721 AGAGACGTAG GGGGTACTTT CGCTTCGAGT CCGTCGTGGT CTGATTCGCA GCATCTGCAT781 CCTAGGTAGT CTTGCGGGCG ACCGAGACTT CTTTCAAACA CCATCCTCGG TCGAGGGATA841 AACACGTCAC GGGAAGGAGA CTTGGTTTCG TAGAGCCAGC ATTCCGAAAA CAGTATCGAG901 TTCGGATTAG TATCCAGATA GTGCCTGCAG AGTAGCAAAG TGGTCTTGTC CACGAGCTCA961 GTTAGTCGGT TGTCCTCGTC TCGAAGAGCT GCTGTGTCTT GGCTGAGCTG GACTTTTCGG1021 GCAACGACGG TGGTGCGCAT GACCTTGCTA TGACCGCTGA ATTTGCTCCT CAAAACAGTG1081 CCAGCATCCT TGGCCCGTAC CTTGAGATGC TCGAGCTCTT GCATGACGGA TTCGAGCGAT1141 GCGCGTAGCT GCGCACCTCG CTCATCAGCA GACGGCAGCA ATCCAAGTGA CCTGTCCCCT1201 TCACCAAGCA CTGAAACGAT CCGGGCAAGA AGCCCCGACA ACTCGTCAGG GTCCATGCGG1261 CGAATGCTCT GAGCCAAGCC CGGGTCATCC GAAGACAGCT GAGCTCTGAC CAAACCATCC1321 ACGTAGGCTC TGGAAAAGGA GCTCCTCTGG ACGCCGGCAG CTCGCGAAAT CAGCAGAGAC1381 CGAAGGAATT GGGCTGCCCA CGATTGCCGG TTGCCATGGC CTGCCCTGAT TCGATTGAGA1441 AGATGTTTGT TATCCTCAAT CAATAATCGT GCATCTTCCA AGG