基因工程生产人生长激素.docx

生物制药作业 黄德平 学号：0942041016 2012-04-10基因工程生产人生长激素黄德平（生命科学学院,生物技术专业,学号：0942041016）摘要：人生长激素（HGH）是一种非糖基化多肽激素，可以刺激身体生长，临床上有重要应用。HGH来源十分有限，起初只能从人尸体的脑垂体中提取，远不能满足临床用药要求。现代基因工程为该激素的生产带来了生机，通过体外大量培养微生物来大量产出重组型人生长激素（rHGH）。本文重点阐述基因重组大肠杆菌发酵生产rHGH的主要技术路线。关键词：重组人生长激素（rHGH） 大肠杆菌 发酵Genetic engineering production of humand growth hormoneHuang Deping（NO.0942041016, Major in Biotechnology,Life Science School）Abstract: HGH is a kind of non-glycosylated polypeptide hormone,which can promote the body growth and is of great importance to clinical practice. The source of HGH is so limited that the drug supply is far from meeting the demand. HGH is separated and extracted from the pituitary gland of corpses before the gene engineering brings new vitality into industrial production of HGH.Now we can use recombinant e.coli to produce abundant HGH through the fermentation engineering method.And this article is mainly about the strategy of rHGH production，the process route，the existing problems and solutions.Key Words: recombinant human growth homone(rHGH) e.coli fermentation4科学家研究发现人生长激索(HGH)是一种由脑垂体前叶分泌的非糖基化的蛋白质激素，天然HGH是单链球形酸性蛋白质（等电点5.2），共191个氨基酸残基组成，分子大小约为22KD，含有两对二硫键，无糖基化，可通过链间的二硫键形成二聚体。深入的科学研究表明，HGH的N端1134位Aa肽段是必需活性序列，C端肽段则起到稳定HGH分子，防止HGH被血液中蛋白酶降解；HGH是外分泌性蛋白质，新生肽链为活性激素的前体，需通过切除信号肽来活化1。人生长激素具有促进骨骼、内脏和全身生长，激活蛋白质生物合成，影响脂肪和矿物质代谢等重要作用，是机体发育的关键激素之一2,3。目前，HGH在临床主要应用于青少年矮小症、外科术后和重症烧伤、心衰、抗衰老等方面3。随着人口老龄化的加剧，心血管疾病患者日益增加，rhGH在治疗心血管疾病方面的应用越来越重要。此外有报道称长期注射小剂量HGH（0.81U/d），可以延缓各器官系统的衰老，是人的平均寿命增加20岁。目前，人生长激素类药物远远不能满足临床用药需求。由于生物技术的发展，应用基因重组技术已成功生产出重组人生长激素（rHGH），可以通过发酵工程的方法大量生产rHGH。下文将重点阐明通过基因工程方法生产rHGH的技术路线。1.工艺发展概况人生长激素的制备经历了天然提取和基因工程菌发酵生产两个阶段，前者因生长激素的资源限制和提取效率低被淘汰，而后者也经历了两代发展。第一代的rHGH直接在大肠杆菌中表达，得到重组蛋白Met-HGH，即N末端比天然HGH多一个甲硫氨酸，产生了免疫原性2；而且在氨基末端附带的若干氨基酸需要体外降解，切除后才能成为天然HGH2。第二代rHGH为分泌表达型，分泌过程中利用大肠杆菌受体内膜上的特异性信号肽剪切酶自动切除HGH前体的信号肽，产生与天然蛋白质序列一致的的重组Phe-HGH，同时消除了Met带来的免疫原性2,4。此外利用大肠杆菌和利用真核微生物（包括动物细胞）生产rHGH相比，生产周期较短，产量明显较高。正因为这些优势，使得大肠杆菌生产重组Phe-HGH成为当前生产HGH的主流工艺。2.基因工程生产rHGH工艺流程2.1. rHGH工程菌的构建、筛选及鉴定首先克隆HGH全长基因。根据人生长激素的氨基酸序列，选择大肠杆菌偏好的密码子，人工合成含有20个寡核苷酸的小片段，通过重叠区PCR扩增法合成HGH基因全长序列。在结构基因前加上OmpA信号肽序列，5端设计NdeI酶切位点，3段加上两个终止密码子TAGTGA，并设计BamHI酶切位点5。然后分别酶切处理HGH和PIN-III-OmpA质粒，在缓冲环境及DNA连接酶的作用下合成重组Phe-HGH表达载体（如图-1），并PCR扩增重组分子2。取对数期大肠杆菌，经冰浴的氯化钙低渗溶液处理成为感受态细胞，加入重组质粒，使之与氯化钙形成复合物并黏附在细菌细胞膜表面，再经42热休克处理，重组质粒因细胞膜通透性增加而进入感受态大肠杆菌6。图-1 重组Phe-HGH表达载体2。通过单细胞克隆和检测重组子表达产物的方法筛选重组子，对从组织进行生产鉴定，同时通过二面响应法探索和优化发酵生产条件。最后斜面培养法低温保存工程菌种。2.2.发酵生产rHGH首先进行菌种活化，通过种子罐扩大培养，然后进行发酵罐培养。培养过程中严密监控培养条件并适时调整。其中发酵培养主要参数控制如下7：(1)、种子培养过夜，0D值为2-3范围之内上罐发酵为佳。(2)、发酵培养时间一般为16-18h，培养温度为37。(3)、发酵过程中保持PH值为7O05，溶解氧不低于20。(4)、培养过程中要根据生长状况调节流加葡萄糖、微量元康的流加速度以保持溶解氧不低于20。(5)、发酵培养的茵体OD600值应在70左右，表达的rHGH应是茵体总蛋白的15以上。发酵生产流程如图-2所示：图-2 rHGH原料药生产工艺流程72.3. rHGH的分离纯化2.3.1 rHGH粗提首先分离工程细胞，收集培养液，PH5.5等电点沉淀，硫酸铵盐析，离心分离收集沉淀8。2.3.2 rhGH的层析纯化分别经过G-25层析、PhenylSepharose FF层析、Sephacryl S100层析和DEAESepharose FF离子交换层析纯化rHGH蛋白，使残余DNA、残余工程菌蛋白、相关蛋白、热原均达到相关药典质量标准7,8。2.3.3 rHGH纯度鉴定和活性鉴定纯化后的样品经非还原SDSP AGE、铬银法染色后薄层扫描鉴定纯度，再取纯化rHGH样品，经HPLC法测定蛋白活力（要求比活性大于25 IUml）8。3.总结利用基因工程和发酵工程生产人生长激素（rHGH）是提高生产速度和生产效率的有效途径，能扩大生产量，基本缓解临床用药紧张。但用药需求还在不断增长，生产厂本及药物价格仍然很高，因此必须加强科学研究力度，通过提高工艺水平来价低成本，通过扩大生产量来参考文献：1、朱振洪 葛立军 刘文洪利用重组大肠杆菌生产人生长激素发酵工艺的研究,生物技术通报Biotechnology Bulletin,P217, 2010年第6期2、周珮生物技术制药,P109,人民卫生出版社,2007年7月第一版3、赵东峰 李汉超 王悦然基因工程人生长激素及其应用研究进展,广州化工,2010年38卷第2期4、刘社际,杨立明重组人生长激素在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达研究，生物技术通报Biotechnology Bulletin,P217, 2000年11月4日5、卢希彬 卢步峰 郭礼 篓翁人生长素基因的合成及克隆，生物技术通报Biotechnology Bulletin