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碱性蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及发酵条件优化 摘要 通过测量比较牛奶平板上透明圈的大小，从土壤中筛选出一株高产碱性蛋白酶的菌株BP-10，通过产碱性菌株生理生化试验，16S rDNA序列鉴定为专性嗜碱性芽孢杆菌Bacillus pseudofirmus。然后从酶活为26.34U/ml的10号菌株（BP-10）出发，确定了其最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，在培养36h后达到最大酶活为193.39U/ml，比优化前提高了7.34倍。关键词 碱性蛋白酶 筛选鉴定 培养 发酵优化碱性蛋白酶(Alkaline Protease)是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类，广泛存在于动、植物及微生物生物体中,在猪的胰脏中最早被发现【1】【2】。1945年瑞士Dr Jaag等人在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中发现了碱性蛋白酶【3】。碱性蛋白酶作为工业催化剂已广泛应用于制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业,尤其是作为无磷洗衣粉的添加剂应用广泛【4】，目前碱性蛋白酶的销售量大约占全世界每年总销售量的30%左右【5】。但洗涤剂用碱性蛋白酶要求其在广泛的pH和温度范围内保持较高的酶活力和稳定性,同时还必须与含有多种氧化剂、鳌合剂和表面活性剂的洗衣粉相融合。目前,在工业应用中的很多碱性蛋白酶存在弊端,例如在表面活性剂、氧化剂、热稳定性、酸碱稳定性方面及培养基成本较高等【6】【7】。因此,筛选新的高产碱性蛋白酶菌株和对其产碱性蛋白酶的酶学条件研究具有重要的理论意义和应用价值，同时利用基因工程手段进行改造将是以后研究的重点方向。本实验从土壤中筛选出若干产碱性蛋白酶的菌株并摸索了其酶学性质及产酶的最始条件，为后期改造菌种提供了基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土样来源河南工业大学的花园、树林1.1.2 培养基【8】 牛奶培养基：酵母粉0.5g、琼脂粉2g、脱脂奶2g及0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液pH10.0、蒸馏水100ml。 种子培养基：酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、葡萄糖1g、K2HPO4 1.8g、水100ml。 基本发酵培养基:葡萄糖1.00g、酵母粉1.00g、K2HPO40.1g、干酪素0.10g、氯化钠1.00g及0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液(pH10)100ml溶解。 以上培养基均在121下灭菌20min1.1.3 主要试剂 干酪素、三氯乙酸、酪氨酸、福林试剂、硼砂、葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨及其他试剂均为市售分析纯；所用到的分子试剂均购于上海生工生物工程有限公司。1.2 方法1.2.1 产碱性蛋白酶菌株的筛选初筛 称土样l0g于装有90mL无菌水的三角瓶内，振荡，静置，吸取0.1ml菌悬液于另一个装有0.9ml无菌水的1.5ml的离心管内，振荡均匀，既得10-1的稀释液，然后以此方法继续稀释得到10-2、10-3的稀释液。吸取0.2ml稀释菌液（10-1、10-2、10-3）涂布于牛奶平板培养基中，30恒温培养24h48h后，根据透明圈的有无，挑取透明圈直径较大的菌落，进行分离纯化、斜面保藏。复筛 将初筛的菌株经斜面活化后接种于种子培养基中，30、200rpm培养12h，按2%的接种量接入50mL发酵培养基中，30、200rpm培养48h，10000rpm离心5min，取上清液测定蛋白酶活力。1.2.2 碱性蛋白酶活力测定 按轻工业部颁标准QB/T 1803-93：Folin试剂显色法【9】。规定将lml酶液在40、pH10.5，每分钟水解酪蛋白产生lg酪氨酸所需的酶量定义为1个酶活力单位（U/ml）。1.2.3 菌株16S rDNA序列鉴定菌株16S rDNA序列由上海生工公司测序。使用细菌基因组DNA小量纯化试剂盒提取细菌基因组DNA，PCR所用引物为：16S-F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-316S-R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。50LPCR反应体系：2Taq Master Mix 25L，上下游引物各2L，模板DNA1L，无菌去离子水补充至50l；程序：95，5min；95，30s；50，30s；72，2min；72，10min；30个反应循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收测序。登录GenBank数据库，同相关菌株比对，确定筛选出的菌种。1.2.4 不同碳源对产酶的影响 分别配制四种用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉作为唯一碳源的发酵培养基（pH10），其他条件保持一致，将四种培养基灭菌，37C摇床培养24h，测定酶活,选定最佳碳源。1.2.5 不同氮源对产酶的影响分别配制五种用牛肉膏、蛋白胨、豆饼粉、尿素、硫氨酸作唯一氮源的发酵培养基（pH10），选用测定上一组最高酶活的碳源作为唯一碳源，其他条件保持一致，37C摇床培养24h，测定酶活，选定最佳氮源。1.2.6 不同金属离子对产酶的影响配制五瓶用上述最佳氮源、碳源制作的发酵培养基，其他条件一致，往培养基中分别加入1%的含Ca2+、Ma2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+化合物，37摇床培养24h，测定酶活，选定最佳金属离子。1.2.7 不同pH对产酶的影响配制五瓶以最佳培养组分制作的发酵培养基，用0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液（过滤灭菌）将培养基的pH分别调至8、9、10、11、12，在无菌操作台上从种子培养基中接种至发酵瓶中，放入37C摇床培养箱中24h，测定酶活，选定最佳pH1.2.8 跟踪实验用测定出来的最佳C源、N源、pH、金属离子配制发酵培养基，其他条件不变，将发酵培养基灭菌，在无菌操作台上从种子培养基中接种至发酵瓶中，放入37C摇床培养箱中，在12小时、24小时、36小时、48小时、60小时分别测定酶活。空白对照：用最开始使用的发酵培养基培养菌种，发酵24h后测定其酶活，将其作为空白对照。2 结果与分析2.1 产碱性蛋白酶菌株的分离采用碱性平板分离法，从第一步分离中筛去了大量不能在碱性平板上生长的微生物， 进一步通过发酵培养基的筛选，从土样中分离出碱性蛋白酶酶活较高的菌株。从河南工业大学土壤中分离出的菌株，其中10种菌株在初筛平板上生长并产生明显的水解圈，将其编号为1-10,说明这些菌株均分泌胞外蛋白酶。在摇瓶发酵复筛过程中发现,10种菌株所产的蛋白酶在碱性条件下（pH10）均有活性，然后测定碱性蛋白酶活力，筛选出6株酶活力较高的菌株，现将这6种菌株命名为BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-5、BP-6（结果见表1）。其中菌株BP-10酶活力最大，因此选用BP-10作为研究产碱性蛋白酶菌株产酶条件的出发菌株。表1 产碱性蛋白酶菌株的初筛、复筛Table 1 Screening of the strains for alkaline protease-producing编号吸光度酶活（U/ml）BP-10.0772.957BP-20.1596.110BP-30.1043.990BP-80.31712.170BP-90.1003.840BP-100.68626.3402.2 菌株BP-10的16S rDNA鉴定对BP-10产碱性蛋白酶菌株的16S rDNA基因序列同源性的比较结果表明，它与已报道的专性嗜碱芽孢杆菌Bacillus pseudofirmus的16S rDNA序列的一致性为99%，说明筛选的菌株是芽孢杆菌属。图 1 10号菌株的测序结果2.3 不同碳源对产酶的影响以干酪素作为氮源，在发酵培养基中加入不同的碳源，37C培养一天后，各不同碳源培养基的酶活力结果如表2。由图2可知，菌株BP-10以葡萄糖为碳源产酶最高，麦芽糖次之，最弱的是蔗糖。而姚刚等【10】的研究则表明蔗糖对pH值有较强的缓冲能力是枯草芽孢杆菌产酶的最佳碳源，Phadatare 【11】Conidobolus coronatus 的研究也表明，蔗糖是枯草芽孢杆菌生长和产酶的最佳碳源，这说明不同的芽孢杆菌对于碳源的选择利用可能不一样。表 2 不同碳源对产碱性蛋白酶的影响Table 2 Effect of carbon source on productivity of alkaline protease碳源吸光度酶活U/ml蔗糖0.65361.7298.6598.1685.58葡糖糖1.026麦芽糖1.021淀粉0.894 图 2 最佳碳源的选择2.4 不同氮源对产酶的影响选用葡糖糖为碳源，在发酵培养基中加入不同的氮源，37C培养1天后，测定各不同氮源的培养基的酶活力如下表3。由图3可知，专性嗜碱性芽胞杆菌在以蛋白胨作氮源的培养基中酶活力最高，牛肉膏次之，豆饼粉酶活力最低。氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，不同菌种对氮源种类的要求及利用程度不一致。有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基之外，还含有少量糖、脂肪、微量元素等，同时还有价格低的优点，因此适合用于实验室发酵培养。表 3不同氮源对产碱性蛋白酶的影响Table 3 Effect of nitrogen source on productivity of alkaline protease氮源吸光度酶活力（U/ml)牛肉膏1.442139.84蛋白胨1.572152.91豆饼粉0.98694.69尿素1.108106.77硫氨酸1.090104.99图 3 最佳氮源的选择2.5 不同金属离子对产酶的影响将不同的金属离子加入发酵培养基中，培养一天后测定其酶活，结果见表4。从图3中可以看出，存在金属离子的条件下，酶的活力普遍增高。其中碱性蛋白酶在Ca2+的条件下酶活力最高，添加Zn2+对酶活力的影响不是很大。薛林贵【12】等筛选的G-41菌株通过添加2 104mol/L浓度的Ca2+显著提高了酶活力；唐兵13研究的嗜热脂肪芽孢杆菌所产蛋白酶高温中性蛋白酶，Ca2+能提高其热稳定性，提高产酶能力。表 4不同金属离子对产碱性蛋白酶的影响Table 4 Effect of metal ions on productivity of alkaline protease金属离子吸光度酶活U/mlCa2+2.003193.39Mg2+1.618157.27Zn2+1.449140.53Fe2+1.715166.87Mn2+1.694164.82.6 pH对酶活的影响2.6.1 发酵pH对酶活的影响配置pH值分别为8、9、10、11、12的发酵培养基，接入菌种，在37C培养1天后，测定其酶活，结果如表5.由图4可知，碱性蛋白酶在弱碱性条件下，酶活随pH增大而增大，在pH到9时酶活达到最大，然后随着pH的增大酶的活力逐渐降低。表 5 不同发酵 pH条件下的结果Table 5 Result of various pH fermentation conditionspH吸光度酶活（U/ml）81.127108.6591.54149.54101.082104.2111.072103.2120.98294.3图4 不同初始pH对产碱性蛋白酶的影响2.6.2 反应pH对酶活的影响 在pH值分别为8、9、10、11、12的不同缓冲液中测定碱性蛋白酶的活力。从表6可知碱性蛋白酶在pH值9的缓冲溶液中活力最大。表 6不同反应pH值对酶活影响Table 6 Effect of various reaction pH on enzyme activitypH吸光度酶活（U/ml）81.154111.3391.323128.06101.146110.53111.11106.97121.0399.05图5 不同反应pH对产碱性蛋白酶的影响2.7 跟踪实验以蛋白胨为氮源，葡萄糖为碳源，加入Ca2+ 化合物溶液，在pH值9的发酵培养基中37摇床培养，测定目的菌株经过12h、24h、36h、48h、60h、72h的酶活，从图6中能够看出，酶活在12-36h之间逐渐增大，到36h后酶活逐渐减小。图6 不同发酵时间下的酶活3 结论以河南工业大学花园土壤为原料，经过初筛与复筛，得到一株高产碱性蛋白酶的菌株BP-10，其初始产酶能力为26.34U/ml，经鉴定为专性嗜碱性芽胞杆菌。通过对其产酶条件的研究得出：发酵培养基中最佳碳源为葡糖糖，最佳氮源为蛋白胨；当起始pH为9时，该菌株有较高的产酶活力；添加Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+ 、Mn2+均能提高产酶能力，尤其是Ca2+，这时的最大酶活为193.39U/ml；通过对目的菌株不同时期酶活力的测定，确定了其最佳产酶时期在36h时。参考文献1黄家福,潘裕添，陈俊玉，等.地热田碱性蛋白酶菌株的选育与酶性质的研究.漳州师范学院学报(自然科学版),2011年第1期2褚忠志 .于新.短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的提纯与性质研究.甘肃农业大学学报,2008年10月第6期166 169 3肖怀秋,林亲录,李玉珍,等.微生物碱性蛋白酶研究进展.中国食品添加剂,2005,No.154李宏,刘成君,王兰.高温碱性蛋白酶菌株的选育及酶性质研究.研究报告5成堃，路福平，李玉，等