微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究Ⅰ. 菌株的分类鉴定.doc

微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究. 菌株的分类鉴定中国抗生素杂志 2000年第2期第25卷 论著作者：田敏张新宜刘瑜俞朵吕淑君李建明单位：田敏 张新宜刘瑜俞朵吕淑君（四川抗菌素工业研究所，成都610051）；李建明（长征制药股份有限公司，四川乐山 614006）关键词：他克莫司(FK506)；千佛链霉菌新种；菌种分类摘要从我国山东省济南市郊外千佛山土壤中分离到一株放线菌，编号SIIA-9818，气生菌丝灰白色或白色，基内菌丝分枝、无横隔、不断裂。在大部分培养基上基丝为白色，不产可溶性色素，分生孢子丝直型，波曲或钩状，孢子椭圆型或圆柱形，孢子表面光滑，绝大部分碳源不能利用，生长温度偏低，细胞壁化学组份分析含L，L-二氨基庚二酸和甘氨酸，产生新型免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus，FK506)。根据分类研究，菌株SIIA-9818归属于链霉菌属，与已知近似菌株比较存在明显差异，定名为千佛链霉菌新种SIIA-9818(Streptomyces qianfoensis sp.nov.SIIA-9818)。 Taxonomic study on the S-9818 producing strain SIIA-9818Tian Min，Zhang Xinyi，Liu Yu，Yu Duo，Lu ShujunandLi Jianming(Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu 610051)ABSTRACTStrain SIIA-9818 was isolated from soil samples collected in the Qianfo Mountain at Jinan, Shandong province, China. It forms straight, flexible or hook chains of spores with greyish white or white colored.Smooth-surfaced spores were oval or cylindrical. It can not use many kinds of carbohydrate. Temperature range for growth is low. Chemical composition of cell wall contains L,L-DAP and glycine. The strain produces immunosuppressant compound FK506. Based on the results of morphological, physiological and chemotaxonomic characteristic studies, strain SIIA-9818 was placed in the genus Streptomyces and identified as a new species of Streptomyces, proposed the name Streptomyces qianfoensis sp.nov.KEY WORDSFK506；Streptomyces qianfoensis sp.nov.；Taxonomy他克莫司(tacrolimus，FK506)是1984年由日本藤泽制药公司的研究人员以淋巴细胞IL-2(白细胞介素-2)的产生为靶位筛选到的与环孢素(CsA)具相似免疫作用机理的微生物产物，该新型免疫抑制剂抑制各种免疫反应的活性较CsA强10100倍。1993年以商品名Prograf在日本上市，并于1994年获FDA批准在美国用于肝脏移植。在以粘附分子LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)及其配体ICAM-1(细胞间粘附分子-1)的结合抑制为靶位，从微生物次级代谢产物中寻找免疫抑制剂的筛选*过程中，我们从山东省济南市郊外千佛山的土壤中分离到一株放线菌，编号SIIA-9818。该菌次级代谢产物S-9818经结构论证，证明与FK506同质。结构鉴定结果另文报道。本文报道活性化合物S-9818产生菌SIIA-9818的分类鉴定结果。1材料和方法1.1菌株来源从我国山东省济南市郊外千佛山土壤中分离获得，编号SIIA-9818。1.2形态观察在燕麦汁琼脂(ISP3)培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片，28培养730d，用光学显微镜和扫描电子显微镜观察菌丝，孢子丝及分生孢子的形态特征。1.3培养特征主要采用国际链霉菌计划(ISP)和Waksman所推荐的培养基1，28培养730d，观察其培养特征并进行描述。1.4生理生化反应采用国际链霉菌计划(ISP)推荐的方法，碳源利用实验以ISP9为基础培养基，28培养330d，观察并记录结果。1.5细胞壁化学组份分析参照Lechevalier等推荐的方法进行2。2结果2.1形态特征SIIA-9818菌株在ISP2、ISP3、ISP4及ISP7培养基上培养714d，生长丰茂，基丝分枝，无横隔，不断裂，直径:0.81.0m，分生孢子丝直型，波曲或钩状，孢子椭圆形或圆柱形，0.60.90.91.3m，孢子表面光滑(图1、2)。2.2培养特征SIIA-9818菌株在酵母麦芽浸汁琼脂培养基上生长丰富，孢子灰白色，基丝棕色，产棕色可溶性色素，该菌在其它各种培养基上的培养特征见表1。2.3生理生化特征SIIA-9818菌株在蛋白胨-明胶培养基上能液化明胶，牛奶胨化不凝固，淀粉水解阴性，不利用纤维素，硝酸盐还原阴性，不产生类黑色素和H2S。碳源利用情况：仅利用水杨苷和卫茅醇，微弱利用D(+)甘露糖，不利用葡萄糖、蔗糖、棉子糖、D-果糖、甘露醇，D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、肌醇和乳糖。适应于低温生长，1028生长丰茂，高于37不生长。图1SIIA-9818菌株孢子丝(3500)图2SIIA-9818菌株孢子(10500)表1SIIA-9818菌株的培养特征培养基生长情况孢子丝基内菌丝可溶性色素酵母麦芽浸汁琼脂丰茂灰白色棕色棕色(ISP2)燕麦汁琼脂(ISP3)丰茂灰白色白色棕色无机盐淀粉琼脂丰茂灰白色白色无(ISP4)甘油-天门冬素琼脂贫乏白色白色无(ISP5)蛋白胨-酵母膏琼脂贫乏无无色无(ISP6)酪氨酸琼脂(ISP7)中度灰白色棕色浅棕色查氏蔗糖琼脂中度白色白色无查氏葡萄糖琼脂中度灰白色白色无天冬素葡萄糖琼脂中度白色白色无高氏1号琼脂贫乏白色白色无营养琼脂贫乏无白色无苹果酸钙琼脂不生长2.4细胞壁化学组份SIIA-9818菌株细胞壁含L，L-二氨基庚二酸(L，L-DAP)和甘氨酸。3菌种鉴定菌种SIIA-9818其细胞壁组分含L，L-DAP和甘氨酸，结合其形态特征，证明该菌株应归属于链霉菌属3，将该菌株与已知近似的链霉菌及已知的FK506产生菌比较，结果见表2、3。比较结果可看出菌株SIIA-9818与各近似菌株相比均存在不同程度的差异。谷氏链霉菌S.gougerotii4孢子梭状、在ISP2、ISP3、ISP4培养基上气丝生长少，在ISP2、ISP3培养基上不产可溶性色素，而SIIA-9818菌在ISP2、ISP3、ISP4培养基上生长非常丰茂，在ISP2和ISP3培养基上可产生棕色可溶性色素。S.gougerotii菌株可利用D-木糖、葡萄糖、甘露醇、D-果糖作为生长碳源，而SIIA-9818菌株对以上各碳源均不能利用。与另一近似菌白直丝链霉菌S.alborectus5相比，它们孢子丝均为直型或柔曲状，孢子椭圆至柱形，孢子表面光滑，在ISP2、ISP3、ISP4培养基上生长丰茂，ISP5培养基上生长贫乏，在大部分培养基上基丝白色或淡黄色，可溶性色素无或很少，淡黄，但S.alborectus菌株在ISP3培养基上不产可溶性色素，而SIIA9818菌株产棕色色素。S.alborectus菌株可利用葡萄糖、D-果糖和D-半乳糖，在ISP1培养基上有黑色素产生，有水解淀粉和还原硝酸盐的能力，而SIIA-9818菌却与之相反，两者的代谢产物也不相同，SIIA-9818菌株产FK506，S.alborectus菌株的代谢产物为维吉霉素。SIIA-9818菌株与其他已知的FK506及其结构类似物FK520，FK523的产生菌相比，相似性也很小，FK520和FK523的产生菌为吸水链霉菌6，FK506的另一产生菌S.tsukubaensis(筑波链霉菌)7与SIIA-9818菌在形态特征上极为相似，在生理生化及碳源利用方面几乎完全相同，但S.tsukubaensis菌在各培养基上基内菌丝颜色为淡粉红至红橙黄，淡棕色，而SIIA-9818菌除在ISP2和ISP7培养基上基丝为棕色外，在其他培养基上基丝均为白色或无色。其属水平相关性DNA-DNA同源性研究结果也显示菌株SIIA-9818不属于吸水链霉菌，也不属于筑波链霉菌。由此，我们认为菌株SIIA-9818为链霉菌属中的一个新种，建议定名为Streptomyces qianfoensis sp.nov.(千佛链霉菌新种)。该菌株保藏于国家菌种保藏委员会抗生素菌种保藏中心。表2SIIA-9818菌与已知近似菌种形态及培养特征比较SIIA-9818S.gougerotii(谷氏链霉菌)S.alborectus(白直丝链霉菌)S.tsukubaensis(筑波链霉菌)形态特征孢子丝直，波曲或钩状，孢子椭圆形或圆柱形， 孢子孢子丝直型，孢子梭状，孢子表面光滑，基丝有时断裂。孢子丝直，柔曲，孢子椭圆形至长圆形，孢子表面光滑。孢子丝直，柔曲孢子长椭圆形或圆柱形，孢子表面光滑。表面光滑。培养特征ISP2Am：丰茂，灰白色Am：少，白或淡黄Am：丰茂，绒状，浅褐灰色Am：中度，淡灰色Sm：棕色Sm：无色至灰黄色Sm：薄，无色至黄褐色Sm：暗红橙黄色Sb：棕色Sb：无Sb：淡黄褐色Sb：暗红橙黄色ISP3Am：丰茂，灰白色Am：少，白或淡黄Am：丰茂，粉状白色Am：中度，灰色Sm：白色Sm：无色至灰黄色Sm：薄，无色至淡黄色Sm：淡粉红Sb：棕色Sb：无Sb：无Sb：无ISP4Am：丰茂，灰白色Am：少，白或淡黄Am：丰茂，白色Am：中度，淡黄桔至浅灰色Sm：白色Sm：无色至灰黄色Sm：黄灰色Sm：深橙黄色Sb：无Sb：无Sb：很少，淡黄Sb：无ISP5Am：贫乏、白色Am：少，白或淡黄Am：贫乏、白色Am：中度，淡粉红至白色Sm：白色Sm：无色至灰黄色Sm：淡黄色Sm：淡粉红Sb：无Sb：无Sb：很少，淡黄Sb：无查氏蔗糖琼脂Am：中度，白色Am：中度、白色Am：贫乏Sm：白色Sm：无色Sm：淡粉红Sb：无Sb：无Sb：无天冬素葡萄糖Am：中度，白色Am：薄，白色Am：丰茂，白色Am：贫乏，白色琼脂Sm：白色Sm：无色至微黄色Sm：无色至淡黄Sm：淡棕色Sb：无Sb：无Sb：很少，淡黄Sb：无表3SIIA-9818菌株与已知近似菌种生理生化及碳源利用比较菌种名称SIIA-9818S.gougerotii(谷氏链霉菌)S.alborectus(白直丝链霉菌)S.tsukubaensis(筑波链霉菌)碳源利用L-阿拉伯糖-D-木糖-+-葡萄糖-+蔗糖-肌醇-L-鼠李糖-棉子糖-甘露醇-+-D-果糖-+-D-半乳糖-+-生理生化特性ISP1-+-明胶液化+牛奶凝固-牛奶胨化+(快)+淀粉水解-+-硝酸盐还源-+-生长温度1028生长丰茂，高于37不生长537生长1835生长，28为最适生长温度代谢产物FK506kabicidinvirginiamycinFK506(卡比杀菌素)(维吉霉素)：不利用；：利用；：利用可疑。致谢：本菌种鉴定工作得到四川抗菌素工业研究所胡润茂研究员的指导，特此深表感谢！该模型的建立及样品筛选为国家新药研究基金资助项目，文号：97Q04。田敏，女，生于1965年，学士，副研究员。参考文献1，Shirling E B, Gottlieb D. Methods for characterization of streptomyces species. Int Syst Bacteriol，1966；16：3132，Mary P, Lechevalier H. Biology of the actinomyces and related organism. Biol Actinomycetes，1976；11：783，阎逊初. 放线菌的分类和鉴定. 北京：科学出版社，1992：604，阎逊初. 放线菌的分类和鉴定. 北京：科学出版社，1992：5605，Ogata K, Matsuura M, Irie H, et al. A new species of Streptomyces producing Virginiamycin family antibiotics. J Antibiot，1978；31：13136，Hatanaka H, Iwami M, Kino T, et a