细胞凋亡(apoptosis)的检测.docx

细胞凋亡（apoptosis）的检测 细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式。其发生诱因及形态学特征均有别于坏死，与人类免疫系统的发生发展、神经组织发育、器官的形成、肿瘤的发生发展等诸多生物学现象之间有着密切联系，并且是免疫应答过程中免疫细胞的杀伤机制之一。细胞凋亡的检测技术已成为免疫学检测的一个重要内容。凋亡细胞具有典型的形态学、生物化学及分子生物学变化，从这些特点出发发展起来的检测方法有形态学鉴定、电泳法、免疫学方法、流式细胞术、原位末端转移酶标记技术、靶细胞DNA片段的定量等。(一)放线菌酮制备大鼠淋巴细胞凋亡模型【原理及意义】放线菌酮（CHX）是一种蛋白合成抑制剂，可诱导小鼠和大鼠的脾、粘膜免疫系统及淋巴结的淋巴细胞发生凋亡。此实验旨在体外研究淋巴细胞凋亡的生物学特征。【材料】动物：昆明种小白鼠，大鼠。试剂：PBS缓冲的4%多聚甲醛或2.5%的戊二醛，放线菌酮（用PBS或生理盐水配成1mg/mL的浓度，除菌过滤，4冰箱保存）。器材：眼科镊，眼科剪，剪刀，玻片。【方法】大鼠用乙醚麻醉后，从腹腔（静脉或皮下）给大鼠注射3mg/kg体重CHX。注射2h后，取大鼠脾脏（肠或子宫亦可）等组织，剪成一定大小的组织块，固定于固定液中。固定组织经HE染色作光镜检查或电镜检查。【结果】一般在注射后不久就可在脾及其它粘膜免疫系统出现大量凋亡的淋巴细胞（以淋巴细胞为主）。经HE染色后在光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等。坏死组织则呈均质红染的无结构物质，核染色消失。【注意事项】由于机体内巨噬细胞对凋亡细胞的清除作用，凋亡细胞形成的高峰期在3h左右，在5h后组织内凋亡细胞已经很少，所以取材最好不要超过4h。另外，放线菌酮的剂量要控制在25mg/kg体重。制备成功的模型一般比较稳定。(二)活化诱导的淋巴细胞凋亡检测【原理及意义】活化诱导的淋巴细胞凋亡（AICD）是免疫调节的重要途径之一。体外研究淋巴细胞的凋亡将有助于防治因淋巴细胞过度活化而导致的自身免疫性疾病和免疫损伤。已知IL10、TGF、IFN均可体外诱导或淋巴细胞凋亡。本试验重点介绍研究淋巴细胞凋亡常用的检测方法。（1）活细胞悬液吖啶橙荧光染色法【材料】 试剂：吖啶橙贮存液（10mg吖啶橙溶解于100mLPBS中，过滤，4避光保存），0.01mol/L、Ph6.8PBS。器材：吸管，试管，玻片，荧光显微镜。【方法】制备待检活细胞悬液，浓度约为110/mL。取95uL的细胞悬液，加5uL的吖啶橙贮存液混匀。吸一滴混合液，点于洁净玻片上，直接用盖玻片封片。荧光显微镜观察或避光保存于4，待观察。【结果】在荧光显微镜下，细胞核DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄色或桔红色荧光。出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片。细胞坏死时，细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可减弱或消失。（2）琼脂糖凝胶电泳法【原理及意义】培养或单细胞悬液用细胞裂解液消化细胞按常规法提取DNA后，置于含溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，细胞出现PCD时呈典型的“梯状”条带，而坏死时，呈模糊的弥散膜状条带。【材料】试剂：缓冲液，细胞裂解液，Rnase（10mg/mL溶于TE缓冲液中），醋酸钠，乙醇，苯酚和氯仿。器材：电泳槽，电泳仪。【方法】约10细胞洗脱后，1000/min离心5min，去上清。用4mL的PBS重悬洗后，同法离心去上清。置液氮中骤冷，5min（无条件可省略）。加0.51mL细胞裂解液重悬细胞，50，过夜，不时振摇。加等体积酚和氯仿、异戊醇各抽提1次（充分混匀，5000，5min）。取上清加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，混匀。液氮10min，1000，5min离心沉淀DNA，70%乙醇洗次后，真空抽干，溶入500uLTE缓冲液中。加入25uL Rnase，37水浴，30min。取所制备的样品1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察。【结果判断】 细胞出现程序化细胞死亡时，在琼脂糖凝胶电泳带上呈现有一定间隔的梯状条带，而细胞坏死时则呈模糊的片状条带（无间隔），阴性对照者仅在近电泳点样处出现基因组条带。（3）流式细胞仪观察PI染色法【原理及意义】细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型峰的特征。此外，根据细胞光散射特点，应用碘化丙啶（PI）染色可使之与坏死相区别。在直方图上，凋亡细胞出现亚二倍体峰，表现为二倍体峰（细胞）的减少，在峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。而坏死时，细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少，亚二倍体细胞量多少不等。在光散射图谱上，前向光散射与细胞大小有关，细胞凋亡时常表现为细胞皱缩，故前向光散射低于正常。细胞坏死时，常表现为细胞肿胀，故前向光散射高于正常。侧向光散射与细胞内粒子性质有关，由于细胞凋亡或坏死均有细胞内碎片增多，故侧向光散射均高于正常。总之，细胞凋亡出现低于正常的前向散射和较高的侧散射，坏死时则呈较高的前、侧散射光谱。【材料】试剂：碘化丙啶（PI）染色液，Rnase（1mg/mL），70%冷乙醇，0.01mol/L、Ph7.2PBS。器材：试管，流式细胞仪。【方法】（a）标本制备培养细胞（）收集悬浮细胞于离心管中。贴壁细胞视情用酶消化后制成单细胞悬液，悬浮细胞合并。（）8001000/min离心，5min，共2次。（）用400目筛网过滤2次。新鲜实体组织（）取材组织用PBS漂洗干净后，浸泡在含PBS的平皿或青霉素小瓶中。（）用眼科剪尽可能将组织剪碎。（）吸去上清液，组织块转入大瓶中加入1020mL组织消化酶（含200/mL胶原酶），37，30min，并在磁力搅拌器上搅拌。（）在不锈钢网上轻轻研磨，使组织和细胞分离。（）滤液用200目筛网过滤2次。（b）荧光染色：上述细胞制备后均应进行荧光染色。（）制备的单细胞悬液可用70%乙醇固定，4保存。（）染色前用PBS进行离心沉淀去除固定液。（）加200uL Rnase，37水浴30min。（）再加入800uLPI染色液混匀，至4避光30min。（）上机测试。记录激发波长488nm处红色荧光。【结果】细胞凋亡时，G1峰左