表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究.doc

表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究 中国预防兽医学报Chinese Journalof PreventiveVeterinary Medicine第41卷第4期2019年4月Vol.41，No.4Apr.2019doi10.3969/j.issn.1008-0589.201804042表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗lBDV感染的研究林庆宇1，师一鸣1，宋丽影1，李雪纯1，谭宏超1，于淑媛1，姜艳平1,2，崔文1,2，乔薪瑗1,2，王丽1,2，周晗1,2，徐义刚1,2，李一经1,2，唐丽杰1,2*(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030；2.黑龙江省动物疾病防控技术与制剂创制实验室，黑龙江哈尔滨150030)摘要为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用，本研究利用IBDV CEF94株感染DF-1细胞，通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性，利用qRT-PCR检测病毒载量，结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖；以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡，利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验，结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组，IBDV的感染对其组织器官的损伤较小，总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加，细胞因子IL- 6、IL- 8、TNF-和IFN-以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高，且提高了雏鸡的存活率。 本实验结果表明，重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平，对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。 本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。 关键词牛乳铁蛋白肽；重组鸡源乳酸杆菌；抗IBDV感染S852.61A1008-0589 (2019)04-0402-06Study on the rebinant chicken originLactobacillus expressing bovine lactoferrin peptides againstlBDV infectionLINQing-yu1,SHI Yi-ming1,SONG Li-ying1,LI Xue-chun1,TAN Hong-chao1,YU Shu-yuan1,JIANG Yan-ping1,2,CUI Wen1,2,QIAO Xin-yuan1,2,WANG Li1,2,ZHOU Han1,2,XU Yi-gang1,2,LI Yi-jing1,2,TANG Li-jie1,2*(1.School ofVeterinary Medicines,Northeast AgriculturalUniversity,Harbin150030,China;2.Heilongjiang KeyLaboratory forAnimal DiseaseControl andPharmaceutical Development,Harbin150030,China)Abstract:In thisstudy,we triedto determinewhether arebinant chickenorigin Lactobacilli/pPG-XLFEC/M11expressing bovine lactoferrin peptidehas effecton protectingchicks frombeing infected by bursaldisease virus(IBDV).The cellviability ofDF-1cells afterinfectedby IBDV CEF94strain was analyzed byCCK-8,and theviral loadin thecells wasdetected byqRT-PCR.Results showedthat thebovine lactoferrin peptide expressedby the rebinant Lactobacilliinhibited theproliferation ofthe virusin vitro.Chicks werechallenged withIBDV virulent UK661strain afterfeeding withthe rebinant Lactobacilli.We observedthat therebinantLactobacilliwas morepotent thanother groupsin attenuating the tissuesand organsdamage inducedbyIBDVvirulentUK661strain.Moreover,pared tothe othergroups,therebinantLactobacilli enhancedthe expressionlevels ofIgG andSIgA inserum,significantly increasedthe mRNAlevels ofIL-6,IL-8,TNF-,IFN-and TLR2,and increasedthe survivalrate ofchicks postthe challenging.These resultssuggested thatrebinant chickenorigin Lactobacilli/pPG-XLFEC/M11expressingbovinelactoferrinpeptidehas aprotective effecton chickinfected withIBDV.Key words:bovinelactoferrinpeptide;rebinantchickenorigin Lactocillus;anti-IBDV infection2018-04-21基金项目“十二五”农村领域国家科技计划(xxBAD12B01-4)；国家自然科学基金项目 (31672461)；哈尔滨市科技创新人才基金(xxRFXXJ084)作者简介林庆宇(1990-)，男，黑龙江肇东人，硕士研究生，主要从事微生物与免疫学研究.*通信作者E-mailtanglijie163.*Corresponding author万方数据乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf)是广泛存在于动物常乳、初乳及其它外分泌液和嗜中性粒细胞中的铁结合蛋白。 1939年Sorensen等首次从牛奶中分离出该蛋白1。 研究显示，Lf与多种生物学功能和保护作用相关，包括肠道中铁离子的吸收、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症和抑菌作用等2-5。 乳铁蛋白肽是Lf经胰蛋白酶分解后产生的小肽，具有Lf的全部生物学功能。 牛乳铁蛋白肽LFcin和LFampin分别由牛Lf的aa17aa41和aa268aa284构成，这两段肽在结构域和空间位置非常接近6，两段肽均具有杀菌、抗病毒、抑制真菌及调节机体免疫等多种生物学功能。 传染性法氏囊病(Infectious bursaldisease，IBD)是由IBD病毒(IBDV)感染产生的雏鸡免疫抑制性疾病7，防控该病的主要措施是雏鸡接种弱毒疫苗，但疫苗免疫对雏鸡的法氏囊也存在一定的损伤8，探究以具有抗病毒功能的乳铁蛋白肽对IBDV感染的作用具有重要意义。 本研究利用实验室构建的表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11，检测其在体外抑制IBDV增殖的活性，并将重组菌饲喂雏鸡，检测其对雏鸡抵抗IBDV感染的作用，为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用，及家禽绿色安全健康养殖提供理想的预防疾病途径。 1材料与方法1.1主要实验材料电转入重组表达质粒pPG-XLFEC的鸡源乳酸杆菌(Lactobacillus saerimneri)M11菌株9pPG-XLFEC/M 11、电转入空载体的乳酸杆菌pPG/M11菌株、IBDV弱毒CEF94株、强毒UK661株、鸡成纤维细胞DF-1株和含IBDV CEF94株VP3基因的阳性标准质粒pMD19-T-VP3，均由本实验室构建并保存；1日龄SPF雏鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 牛乳铁蛋白肽标准品(LFcin)购自武汉星皓生物科技有限公司；鼠抗牛乳铁蛋白肽多克隆抗体由本实验室制备并保存；兔抗Myc单克隆抗体(MAb)和HRP标记山羊抗鼠及抗兔IgG(HRP-IgG)购自英潍捷基(上海)贸易公司；CCK-8试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；RTAce购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；dNTP、RRI购自宝生物工程(大连)有限公司；FastStart UniversalSYBR GreenMaster购自Roche公司；Fast2000RNA提取试剂盒购自迅捷生物有限公司；鸡IgG和SIgA检测试剂盒购自北京诚林生物科技有限公司。 1.2重组菌pPG-XLFEC/M11表达牛乳铁蛋白肽的检测取2mL过夜培养的重组菌pPG-XLFEC/M11，离心后加入终浓度10mg/mL的溶菌酶，371h，超声破碎后取上清，以兔抗Myc标签MAb为一抗(12000)，以山羊抗兔HRP-IgG(15000)为二抗，利用western blot检测上清中牛乳铁蛋白肽的表达，同时以空载体乳酸杆菌pPG/M11为阴性对照。 另以牛乳铁蛋白肽标准品包被ELISA板，鼠抗牛乳铁蛋白肽多克隆抗体(1:400)为一抗，以山羊抗鼠HRP-IgG(1:5000)为二抗，TMB显色后，测定OD450nm数值，绘制牛乳铁蛋白肽浓度的标准曲线。 同一浓度设置3个重复。 根据标准曲线，计算重组菌pPG-XLFEC/M11上清中牛乳铁蛋白肽的含量。 1.3重组牛乳铁蛋白肽的细胞毒性检测将DF-1细胞用0.25%胰酶消化后按2.5105个/mL接种于96孔板中，每孔100L，长至汇合度为90%。 取重组菌培养6h后的破菌后上清，按照TCA浓缩的方法10将牛乳铁蛋白肽分别浓缩至2.728mg/mL、1.364mg/mL、0.682mg/mL、0.341mg/mL、0.1705mg/mL后，将pPG/M11培养后的上清按照相同的方法浓缩至与重组菌表达乳铁蛋白肽为2.728mg/mL相同的倍数(50倍)，分别加入DF-1细胞中继续培养96h，同时设置相同浓度的化学合成肽(LFcin)作为阳性对照，同一个浓度设置5个平行孔，根据CCK-8试剂盒说明书检测，分析重组菌表达的牛乳铁蛋白肽对DF-1细胞的毒性作用。 1.4重组牛乳铁蛋白肽对lBDV在DF-1细胞内增殖的影响将96孔板中长满单层的DF-1细胞弃去培养液，取100L TCID50为10-4.372的IBDV CEF94株分别与100L浓缩后浓度为2.728mg/mL的pPG-XLFEC/M11破菌后上清，100L2.728mg/mL的化学合成肽(Lfcin)以及100L相同浓缩倍数的pPG/M11的破菌后上清，在37、5%的CO2预先作用1h，再接种感染DF-1细胞，同时设正常细胞组和IBDV组作为对照，每组3个平行孔，观察细胞状态，当IBDV对照组发生50%细胞病变时进行CCK-8检测，计算感染病毒后的细胞活性。 利用阳性标准质粒pMD19-T-VP3，参照文献方法11，建立IBDV标准曲线方程。 取各组细胞孔的培林庆宇，等.表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究第4期403万方数据1-5:2.728mg/mL,1.364mg/mL,0.682mg/mL,0.341mg/mLand0.171mg/mL ofrebinant bovinelactoferrinpeptideexpressed frompPG-XLFEC/M11,respectively;6:2.728mg/mL ofthesynthetic lactoferrinpeptide图2重组牛乳铁蛋白肽对DF-1细胞的毒性检测OD450nm2.52.01.51.00.50.012345678养液100L，8000r/min离心5min，利用RNA提取试剂盒提取上清液RNA后反转录成cDNA，以其为模板进行qPCR12分析各组中IBDV核酸的拷贝数。 1.5重组菌对雏鸡抵抗lBDV感染作用的检测选取16只39日龄SPF雏鸡，测定IBDV强毒株UK661(EID50为10-4.5mL/只)对雏鸡的绝对致死量。 按照不同的感染方式设为4组，分别为口服400EID50；口服300EID50并滴鼻100EID50；口服200EID50并滴鼻200EID50；口服100EID50并滴鼻300EID50。 设置7d的观察期，确定IBDV对雏鸡绝对致死量的条件。 选取体质量相近的1日龄SPF雏鸡45只，随机分成3组，重组菌pPG-XLFEC/M11组和空载体乳酸菌pPG/M11组饲喂的活菌数均为2109cfu/只(取1mL过夜培养的乳酸菌离心，用100L PBS重悬)，对照组饲喂等体积的PBS。 自雏鸡7日龄开始饲喂，每次连续饲喂2d，间隔10d饲喂一次，共3次。 在雏鸡39日龄时按照1.5.1的绝对致死剂量条件感染IBDV UK661株，当对照组出现临床症状时，从各组中分别选取5只雏鸡，心脏采血处死，剖检取出肝脏、肾脏和法氏囊组织，经4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片及HE染色，观察雏鸡的组织病理学变化；取上述各组雏鸡采血后的血清及刮取其盲肠的黏液，按照鸡IgG和SIgA检测试剂盒操作说明书，测定鸡血清总IgG与肠黏膜SIgA抗体；采集3组鸡的盲肠扁桃体，经液氮研磨后，利用试剂盒提取RNA并反转录为cDNA，以-actin为内参基因，以qRT-PCR方法检测TLR 2、IFN-、IL- 6、IL-8和TNF-的mRNA转录水平13。 将各组余下的10只SPF鸡，设置5d的观察期并计算其存活率。 2结果2.1重组牛乳铁蛋白肽表达的检测结果重组菌pPG-XLFEC/M11经溶菌酶作用后，经western blot检测，在约16ku处出现特异性反应条带(图1)，与预期结果相符，表明牛乳铁蛋白肽在重组菌中获得表达。 ELISA方法绘制的牛乳铁蛋白肽标准曲线为y=0.459e0.8644x，根据标准曲线计算本研究中重组乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽含量为54.56g/mL。 2.2重组菌表达牛乳铁蛋白肽的细胞毒性检测将重组菌表达的牛乳铁蛋白肽按照不同浓度与DF-1细胞共培养96h后，利用CCK-8试剂盒检测细胞活性，结果显示，重组菌表达的牛乳铁蛋白肽含量达到2.728mg/mL时(TCA浓缩上清50倍)，测定的OD450nm数值与2.728mg/mL的化学合成牛乳铁蛋白肽组、浓缩50倍的空菌pPG/M11上清组以及正常细胞对照组所测定的OD450nm数值相近(图2)，表明各组间细胞活性相似，重组菌表达牛乳铁蛋白肽对DF-1细胞几乎无毒性作用。 2.3重组菌表达牛乳铁蛋白肽对lBDV在DF-1细胞内增殖的抑制作用将浓缩的重组菌破菌后上清与IBDV CEF94株预处理1h后，再作用于DF-1细胞，培养至病毒对照组出现CPE，利用CCK-8法检测细胞活性，结果显示，重组菌组与空载体乳酸杆菌pPG/M11组相比差异显著(p0.05)，与病毒对照组相比差异极显著(p0.01)，重组菌组可以显著改1:pPG/M11;2:pPG-XLFEC/M11;M:Standard proteinMarker图1重组牛乳铁蛋白肽表达的检测45ku28ku16ku16.6ku12M中国预防兽医学报2019年404万方数据善IBDV感染引起的细胞活性降低，但其效果不如化学合成肽组明显(图3A)。 分析各组中的病毒拷贝数，其中病毒对照组为105.02拷贝/L，重组菌组为100.72拷贝/L，空载体乳酸菌为102.18拷贝/L，化学合成肽(Lfcin)组为100.41拷贝/L，重组菌组中IBDV的拷贝数明显减少，与空载体乳酸杆菌pPG/M11组相比差异显著(p0.05)，与病毒对照组相比差异极显著(p0.01)(图3B)。 表明重组牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖。 2.4重组菌对雏鸡抵抗lBDV感染的检测作用将16只健康的39日龄SPF雏鸡随机分为4组，按照不同的感染途径和感染剂量感染IBDV强毒株UK661，最终确定该病毒株绝对致死量的感染途径和剂量为同时口服300EID50及滴鼻100EID50IBDV(图4)。 按照以上确定的感染途径和剂量接种感染IB-DV后，将各组雏鸡心脏采血后处死，采集相应脏器固定后，HE染色观察雏鸡组织病理学变化情况。 结果显示，各组雏鸡的肝脏、肾脏变化均不明显；病毒对照组的法氏囊滤泡萎缩，淋巴细胞大量坏死，结缔组织增生，巨噬细胞浸润；空载体乳酸杆菌pPG/M11组表现为滤泡萎缩，淋巴细胞大量坏死减少，结缔组织增生，局部少量出血伴少量异嗜细胞和巨噬细胞浸润；而重组菌组的法氏囊滤泡只轻度萎缩，仅个别滤泡内可见异嗜细胞浸润(图5)。 表明饲喂表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸杆菌的雏鸡可以在一定程度上抑制IBDV强毒株感染对雏鸡法氏囊组织的损伤作用。 将试剂盒中提供的标准品按照说明书的剂量加入，酶标仪检测OD450nm的数值，绘制免疫球蛋白浓度与OD450nm数值的阳性标准曲线，计算血清总IgG和肠黏液SIgA的含量。 结果显示，表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌可以有效的提高血清中总IgG以及肠黏液中SIgA水平，且血清中的总IgG抗体水平与空载体乳酸杆菌pPG/M11组相比差异显著(p0.05)(图6)。 该组TLR2与细胞因子IFN-、IL- 6、IL-8和TNF-的mRNA相对转录水平均增加，与空载体乳酸杆菌pPG/M11组相比差异显著OD450nm*p0.05，*p0.01图3重组牛乳铁蛋白肽对IBDV的抑制作用AB3210Cell controlpPG/M11LfcinpPG-XLFEC/M11IBDV control6420log10RNA copies/LLfcinpPG-XLFEC/M11pPG/M11IBDV control图439日龄雏鸡感染IBDV绝对致死量的条件Days afterinfectionOral400EID50Oral300EID50,instranasal100EID50Oral100EID50,instranasal100EID50Oral200EID50,instranasal100EID501007550250Survlval(%)01234567图5各组雏鸡的组织病理学变化(100)IBDV controlpPG-XLFEC/M11pPG/M11Kidney LiverBursa ofFabriciusPathology林庆宇，等.表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究第4期405万方数据(p0.05)(图7)。 表明雏鸡饲喂表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸杆菌，可以增强鸡体非特异性的体液免疫和细胞免疫以及炎症反应信号通路的相关分子水平。 雏鸡感染试验结果显示，在IBDV感染后的第5d，对照组雏鸡全部死亡，存活率为0。 空载体乳酸杆菌pPG/M11组雏鸡的存活率为40%，重组菌组雏鸡的存活率为60%(图8)，表明重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽对雏鸡具有一定的抵抗IBDV感染作用。 3讨论许多学者认为，理想的益生菌种最好是从本动物的肠道中分离出来的11，本研究采用表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌Lactobacillus saerimneriM11为基因工程菌株，M119是从雏鸡体内分离筛选得到的，具有较强耐酸、耐胆盐以及较好定植能力。 由于牛乳铁蛋白肽的表达载体是组成型表达载体，因此牛乳铁蛋白肽的表达无需额外添加诱导剂14。 经TCA浓缩，浓度达到2.728mg/mL的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11破菌后上清对DF-1细胞几乎无毒性，说明重组菌表达乳铁蛋白肽的浓度在2.728mg/mL时，DF-1细胞的生长以及生理活性几乎未受到影响。 因此，以2.728mg/mL为工作浓度，检测重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对IBDV在DF-1细胞内增殖的影响。 乳铁蛋白肽抑制细胞病变的结果表明浓缩后的重组菌上清与IBDV预作用1h后，重组菌表达的乳铁蛋白肽可以有效地抑制IBDV引起的DF-1细胞病变，但该效果不如同浓度下化学合成肽(LFcin)抑制IBDV引起的DF-1细胞病变明显；qRT-PCR检测DF-1细胞中病毒粒子拷贝数结果表明浓缩后的重组菌上清与IBDV预作用1h后，DF-1细胞中IBDV病毒粒子的拷贝数相对于病毒对照组显著降低，同样地，在相同浓度下化学合成肽(LFcin)组DF-1细胞中IBDV病毒粒子的拷贝数更低，这可能是由于用TCA方法浓缩得到的乳铁蛋白肽不如化学合成的乳铁蛋白肽纯度高所致。 乳铁蛋白肽的抗病毒活性可能是其与病毒粒子的直接作用从而抑制了病毒对细胞的侵染15；也有研究认为抗菌肽首先与病毒粒子表面黏膜分子结合，使病毒失去与宿主细胞结合的位点，从而阻止病毒侵入细胞16；或者是抗菌肽与细胞表面的一些病毒受体如氨基葡聚糖结合，从而阻止病毒进入细胞内部。 IBDV自然宿主为鸡和火鸡，3周龄6周龄的仔鸡易感，表现为突然发病，死亡集中发生于几天时间之内，死亡率可达50%100%。 本研究将饲喂重组菌后的雏鸡感染IBDV强毒UK661株，当对照组雏鸡出现临床症状时采血处死取样，将法氏囊、肝脏和肾脏制成组织切片，然后在100倍光镜下进行形态观察发现，病毒组的肝脏和肾脏组织几乎没有病理变化，这可能是与IBDV主要侵染鸡法图8重组菌对IBDV感染雏鸡存活率的影响Negative controlpPG-XLFEC/M11pPG/M11Percent survival100806040200012345Days afterchallenge图6重组菌对雏鸡免疫球蛋白的影响图7盲肠扁桃体TLR2和细胞因子的mRNA相对水平Negative controlOD450nm*:p0.05OD450nmNegative controlIgG(g/mL)SIGA(g/mL)*:p0.05Relative mRNAexpressionpPG-XLFEC/M11pPG/M11IgG standardconcentration(g/mL)y=-1E-06x2+0.0039x+0.03290500100032.521.510.503.532.521.510.50020406080100IgG standardconcentration(g/mL)y=1.0775ln(x)-2.0961pPG-XLFEC/M11pPG/M11100806040xx06040xx.01.51.00.50.0IL-6IL-8INF-IFN-TLR-2pPG-XLFEC/M11pPG/M11中国预防兽医学报2019年406万方数据氏囊有关17。 重组菌组雏鸡的法氏囊组织没有发生病变或病变较轻，而空载体乳酸菌组和病毒对照组出现淋巴细胞大量坏死和结缔组织增生，可见重组菌能够抑制IBDV对雏鸡法氏囊组织的损伤。 重组菌组雏鸡的TLR2和相关细胞因子的mRNA相对水平较空载体乳酸菌组明显升高，TLR与触发诱导炎性细胞因子和抗病毒分子IFN的细胞内信号传导途径有关18。 通过TLR2上调激活IFN-以及MyD88依赖性信号通路，从而更快的激活NF-B通路，激发IL- 6、IL-8和TNF-有助于诱导T、B细胞的分化增殖，参与炎症反应，从而达到抗病毒的效果。 血清中IgG和肠黏膜SIgA是发挥抗病毒作用的主要抗体，检测结果发现重组菌组的血清总IgG含量明显高于其它两组，与pPG/M11组相比差异显著(p0.05)；SIgA的分泌量也高于pPG/M11组，表明重组菌能够增强鸡体的体液和黏膜免疫应答水平。 重组菌对IBDV感染雏鸡存活率的影响结果表明，空载体乳酸菌组相比较对照组雏鸡的存活率明显提高，这可能与乳酸菌的益生作用有关。 重组菌组相比较空载体乳酸菌组雏鸡的存活率进一步提高，说明表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌对雏鸡感染IBDV具有较好的保护作用。 本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及禽类疾病的预防奠定基础。 参考文献Nguyen LT,Schibli DJ,Vogel HJ.Structural studiesand modelmembrane interactionsof twopeptides derivedfrom bovinelactoferricinJ.J PeptSci,xx,11 (7):379-389.Baker EN,Baker HM.A Structuralframework forunderstand-ingthemultifunctional characterof LactoferrinJ.Biochimie,xx,91 (1):3-10.Zhang Yue-lei,Lima CF,Rodrigues LR.Anticancer effectsof lactoferrin:underlying mechanismsand futuretrends incancer therapyJ.Nutr Rev,xx,72 (12):763.唐丽杰，邢婧珉，李杰，等.猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及其抑菌活性检测J.东北农业大学学报，xx，43 (6)1-5.唐丽杰，哈卓，赵丽丽，等.猪乳铁蛋白基因的克隆及其重组乳酸菌表达系统构建J.东北农业大学学报，xx，41 (3)79-84.宋丽影，邵怡岚，李雪纯，等.表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌对雏鸡抗鸡白痢沙门氏菌感染的效果研究J.中国预防兽医学报，xx，39 (3)206-209.Ingrao F,Rauw F,Lambrecht B,et al.Infectious bursaldisease:A plexhost-pathogen interactionJ.Dev CompImmunol,xx,41 (3):429-438.Annamalai A,Ramakrishnan S,Sachan S,et al.Prophylactic po-tential ofresiquimod againstvery virulentinfectious bursaldis-ease virus(vvIBDV)challenge inthe chickenJ.Vet Microbi-ol,xx,187:21-30.韩乐濛.组成型表达鸡致病性大肠杆菌fimA与ompC融合蛋白的重组乳酸杆菌的构建及其在鸡肠道定殖特性的研究D.哈尔滨东北农业大学，xx.Nandakumar MP,Shen J,Raman B,et al.Solubilization oftrichloroacetic a