洋葱多糖提取及其抗氧化性研究毕业论文.doc

洋葱多糖提取及其抗氧化性研究目 录摘要3Abstract3前言：41. 材料与方法41.1 材料41.1.1 原料与试剂：41.1.2 主要仪器设备：41.2 方法41.2.1 洋葱多糖的提取41.2.2 洋葱多糖的提取条件研究51.2.3 洋葱多糖含量的测定61.3 抗氧化活性测定71.3.1 抗氧化活性测定原理：71.3.2 抗氧化活性测定流程：82. 结果与分析82.1 单因素选择试验结果分析82.1.1 提取时间实验结果分析（结果见表6，图2）82.1.2 提取温度选择试验结果与分析（结果见表7，图3）92.1.3 料水比选择结果及分析（结果见表8，图4）92.2 正交试验结果与分析（结果见表9）102.3 测定方法稳定性试验112.4 测定方法重现性试验112.5 测定方法的回收率试验（试验结果见表12）112.6 总抗氧化能力测定结果113. 结论123.1123.2123.312参考文献13致 谢14洋葱多糖提取及其抗氧化性研究生物科学与工程学院【摘要】 本实验对洋葱多糖水浸醇提工艺的最佳条件以及洋葱抗氧化活性进行了研究。结果表明，提取洋葱多糖的最佳工艺条件为：提取时间3.5h,提取温度70，料液比1:25。洋葱多糖具有较强的还原能力，且在一定范围内抗氧化活性呈现良好的量效关系。本实验的方法是用水提纯沉法提取洋葱多糖，用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，用分光光度计在490nm波长处测定吸光值。制得葡萄糖标准曲线，其相关系数r=0.9954,回归方程线性关系良好。用抗氧化性试剂盒对不同浓度下洋葱多糖溶液的总抗氧化活性进行测定，效果显著。本实验整套方法简单易行、稳定、快速。【关键词】洋葱；多糖；提取工艺；抗氧化活性。Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Onion PolysaccharideBiological Science and Engineering College Tangmin Major:Biological Technology Student Number: 20083578Advisor：Pang Huizhong（Senior Experimentalist）Abstract The optimum extraction process and antioxidant activity of onion polysaccharide was investigated in this paper.The result showed that the optimum extraction condition was extracting time 3.5h, extracting temperature 70,and the solid to liquid ratio of 1:25.The onion polysaccharide had strong reducing power ,and its antioxidant activity was liner with its concertration to a certain extent.The method of this experiment was extracting onion polysaccharide through hot water extraction and alcohol precipitation.The content of polysaccharide was determined with phenol-sulfuric colorimetry method by measuring the absorbance under 490nm light wave in the spectrophotometry.The standard curve of glucose was manufactured with a correlation coefficient r=0.9954,and the regression equation had a good linear relation.Using antioxidant activity kit to determine total antioxidation under different concertration of polysaccharide had also gained a significant effect.The set of method of this experiment was simple,stable and fast.Keywords onion; polysaccharide; Extraction conditions; antioxidation 前言：洋葱（Allium cep a L）为百合科（Liliaceae）葱属（Allium）植物，近代医学研究发现，洋葱含有硫化物、类黄酮、笨丙素酚类、甾体皂苷类、含氯化合物、前列腺素类和多糖等多种化学成分，具有消炎抑菌、防癌抗癌、利尿止泻及降血糖、降血脂、降胆固醇、降血压、抗血小板凝聚、预防心脑血管病、抗氧化、美容等多种药理作用1。目前，对洋葱中活性成分的研究还主要集中在含硫化合物上，对洋葱多糖的研究很少，国内在此方面的研究更少。多糖是一类广泛存在于动植物、微生物细胞中重要的生物大分子物质。随着分子生物学研究的进展，人们逐渐发现不同来源的多糖具有广泛而复杂的生物学活性，已引起医药界的高度重视，并成为当今生命科学研究的热点之一。本实验以热水浸提、乙醇沉淀的方法从洋葱中提取多糖，并对洋葱多糖抗氧化作用进行初步研究，为进一步开发洋葱的保健作用提供理论依据。1. 材料与方法1.1 材料1.1.1 原料与试剂：新鲜洋葱（购自农大南区食堂）、无水乙醇（AR）、苯酚（AR）、葡萄糖（AR）、浓硫酸（AR）、正丁醇（AR）、三氯甲烷（AR）总抗氧化能力测定试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）。1.1.2 主要仪器设备：植物粉碎机、722型光栅分光光度计（上海精密仪器厂）、电热恒温水浴锅（国华电器有限公司）、德国sartorius型电子天平（精密度为万分之一）、1012型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗仪器厂）、冰箱、TDL4型电动离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.2 方法1.2.1 洋葱多糖的提取洋葱多糖提取的流程为：洋葱切块烘干粉碎称样根据料水比加水定容水浴锅加热浸提取出4000r、15min离心取上清液取一定量加无水乙醇在冰箱内于5下放置24h取出4000r、15min离心取其沉淀物脱蛋白粗多糖。具体如下：（1）、烘干粉碎：将买的新鲜洋葱去除外皮切成小块，盛于托盘放入干燥箱，在80下烘4h，用粉碎机粉碎，过60目筛，放入干燥容器内。（2）、配制洋葱悬浊液：分别取12（正交试验中9支）支试管（每只试管标好号），精确秤取各1.0000g洋葱粉，根据试验设计的各种条件配制各个试管悬浊液。（3）、水溶浸提：将配制好的洋葱悬浊液摇匀后放入恒温水浴锅中，按各自的浸提条件进行水浴浸提，按时取出各试管，冷却至室温，并充分摇匀。（4）、离心：将浸提好的各试管中的洋葱悬浊液于4000r的离心机中离心20min，将各离心管中的溶液倒入已清洗的原试管中。（5）、醇沉：在单因素试验中，除试管、以外的十只试管，从离心所得的上清液中取1/5的量放入离心管中，试管、的则取1/10的量放入离心管中；在正交试验中，各取1/10的量，放入离心管中。再在各离心管中分别加入两倍于上清液的无水乙醇，充分摇匀，放入5的冰箱中醇沉24h。（6）、再次离心：按时从冰箱中取出后于4000r再次离心20min，去掉上清液，取其沉淀物。（7）、脱蛋白：在离心管内加入少量水搅拌溶解沉淀并定容至2ml，在粗多糖溶液中加入该溶液体积的0.2倍氯仿（即0.4ml）和0.05倍正丁醇（即0.1ml）反应30min，经离心去除沉淀即得洋葱多糖溶液。1.2.2 洋葱多糖的提取条件研究1.2.2.1 单因素试验已有的研究结果表明2，影响多糖提取得率的主要因素有：温度、时间、料液比。根据预实验结果，选择浸提时间、温度、料液比3项为考察因素，固定其中两个因素，变化另一个因素，试验见表1。表1 单因素试验方案试验号提取时间（h）提取温度（）料水比11.5801:202.53.54.522.5601:2070809032.5801:101:151:201:251.2.2.2 正交试验根据单因素试验确定的条件，进行正交试验，以得出最佳提取条件。采用L9（34）正交试验，方案见表2，表3。 表2 正交试验因素水平表L9（34）因 素 水平提取温度（） A提取时间（h） B 料水比 C1602.51:152703.51:203804.51:25表 3 正交试验安排表L9（34）试验号温度（） A提取时间（h） B料水比 C160（1）2.5（1）1:15（1）260（1）3.5（2）1:20（2）360（1）4.5（3）1:25（3）470（2）2.5（1）1:25（3）570（2）3.5（2）1:15（1）670（2）4.5（3）1:20（2）780（3）2.5（1）1:20（2）880（3）3.5（2）1:25（3）980（3）4.5（3）1:15（1）1.2.3 洋葱多糖含量的测定1.2.3.1 测定方法：苯酚硫酸比色法原理乙醇沉淀提取多糖以除去单糖、双糖，氨基酸及醇溶蛋白质等干扰成分，然后用水在一定温度下提取可溶性多糖和蛋白质，最终得到多糖、蛋白质的水溶液。然后用丁醇、氯仿脱蛋白，即可得到一定量的粗多糖水溶液，然后进行定量测定。多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚结合生成有色化合物，在490nm波长下，用分光光度计测定其吸光度。1.2.3.2 标准曲线绘制1.2.3.2.1 标准溶液的配制：（1）、0.1mg/ml葡萄糖标准溶液：精密称取在105恒温箱中干燥至恒重的葡萄糖0.5000g,加水定容至100ml精确移取1ml至50ml容量瓶定容即得0.1mg/ml葡萄糖标准溶液。（2）、6%苯酚溶液：称取6.000g苯酚于100ml容量瓶中定容至刻度即得6%苯酚溶液,现配现用。（3）、浓硫酸：直接使用分析纯的浓硫酸。1.2.3.2.2 标准曲线的制备：（结果见表4，图1）准确吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml分别置于各试管中，各加水定容至2.0ml，再各加6%苯酚溶液1.0ml，摇匀；再在冰水中边震荡边缓慢滴加浓硫酸5ml，摇匀后冷却至室温再放入沸水浴中加热15min，再取出放入冰水中冷却至室温。以加0.0ml葡萄糖溶液的试管作为空白对照，于490nm处测吸光度，绘制标准曲线，得回归曲线方程： y = 0.006x + 0.0182，R2= 0.9954 表4 葡萄糖标准曲线试验结果葡萄糖含量（ug）20406080100120A490nm/0.2670.3760.4850.6400.739图1 葡萄糖标准曲线1.2.3.3 样品中洋葱多糖含量的测定1.2.3.3.1 待测样品溶液的配制：在单因素实验中，将除试管、以外的十只试管所得的各样品加蒸馏水稀释10倍，试管、的样品加蒸馏水稀释5倍。在正交试验中，将9支试管所得样品加蒸馏水稀释5倍。以保证待测样品中多糖浓度处于合理区间。1.2.3.3.2 样品中雪莲果多糖含量的测定：精密移取稀释后的各样品液2.0ml，按照作标准曲线的方法即再各加6%苯酚溶液1.0ml，摇匀，缓慢滴加浓硫酸5.0ml，摇匀后冷却至室温再放入沸水浴中加热15min，取出放入冰水中冷却至室温。同时取蒸馏水2.0ml加6%苯酚溶液1.0ml，摇匀，缓慢滴加浓硫酸5.0ml，摇匀后冷却至室温再放入沸水浴中加热15min，取出放入冰水中冷却至室温，作为空白对照。于490nm处测吸光度来测定样品溶液的吸光度，再根据回归方程计算样品中洋葱多糖的含量。（用提取的洋葱多糖提取率表示）1.2.3.3.3 样品中多糖含量的计算：根据绘制的标准曲线得回归方程：y= 0.006x + 0.0812，R2= 0.9954，把所有的吸光值代入上述方程，计算出样品的多糖浓度x，然后再换算成一定质量洋葱多糖提取率W。 提取多糖的量 （查曲线得多糖含量/2）V多糖提取率= 100%= 100% 香蕉皮样品的质量 香蕉皮样品的质量V从1.000g洋葱粉末热水浸提液到待测样品溶液所稀释的的体积总倍数1.3 抗氧化活性测定1.3.1 抗氧化活性测定原理：机体中有许多抗氧化性物质，能使3价Fe还原成2价Fe，2价Fe可与菲啉类物质形成稳定的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。1.3.2 抗氧化活性测定流程：（1）、洋葱多糖溶液的制取：根据正交试验结果确定的最佳浸提条件，并根据最佳浸提条件精确称取3.0000g雪莲果粉，按1.2.1的操作流程操作，得到较高浓度洋葱多糖母液。（2）、将获得的多糖母液通过加一定量的蒸馏水稀释，用苯酚-硫酸法测定稀释后的多糖含量，直至测得的OD值处于0.2-0.7区间及其附近，以保证待测抗氧化活性多糖溶液具有较合理的浓度。按照1.2.3.3.2进行，得到初始洋葱多糖溶液OD值为0.758，按照葡萄糖标准曲线查出多糖浓度为61.65ug/ml。（3）、总抗氧化能力测定试剂的配制：将试剂二的粉剂倒入锥形瓶，加120ml蒸馏水充分溶解，在37水浴锅中加速溶解；试剂三在使用前取贮备液用稀释液以1:19稀释，现用现配。（4）、操作步骤：取12根试管，分成六组，一支实验组（标号为+），一支对照组（标号为-）。把这十二支试管标号为1+、1-，2+、2-，3+、3-，按表5进行，表中A分别代表0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml多糖样本溶液。表5操作步骤表试剂加样管测定管（ml）对照管（ml）试剂一11待测样本A试剂二22试剂三应用液0.50.5充分混匀，37水浴30min试剂四0.10.1待测样本A（5）、测定吸光度：将配制好的溶液混匀放置10min，用蒸馏水作为参比溶液在520nm波长处调零1cm光径，并测定各溶液的吸光度。（6）、计算香蕉皮多糖溶液总抗氧化能力：总抗氧化能力定义：在37时，每分钟每毫升多糖溶液使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。公式：总抗氧化能力（单位/毫升多糖溶液）= （OD1OD2）30nN 0.01 OD1测定管吸光度值OD2对照管吸光度值N反应体系稀释倍数（反应液总体积/取样量）n样本测试前稀释倍数2. 结果与分析2.1 单因素选择试验结果分析2.1.1 提取时间实验结果分析（结果见表6，图2）表6 提取时间实验结果时间（h）2345OD值0.1720.2360.4240.396 图2浸提时间选择由图可知，提取时间在4h时，多糖提取量最大，继续延长水浴时间多糖提取量反而减小。因此，提取时间选择4h较合理。2.1.2 提取温度选择试验结果与分析（结果见表7，图3）表 7提取温度选择试验结果温度（）60708090OD值0.2130.3260.4630.409图3 提取温度选择由图可知，提取温度在6080之间多糖的提取量逐渐增大，至80是急剧减小，因此，采用80提取温度较合理。2.1.3 料水比选择结果及分析（结果见表8，图4）表8 料水比选择结果料水比1:151:201:251:30OD值0.3320.4070.4620.358图 4料水比的选择由图可知，料水比在1:15时多糖提取量较低，至1:25时多糖提取量达到峰值，增加加水量多糖提取量逐渐减少。因此，采用料水比为1:25时较合理。2.2 正交试验结果与分析（结果见表9）表9正交试验设计及极差分析结果试验号 温度（） A提取时间（h） B料水比 C多糖提取率W （%）170（1）3（1）1:20（1）1.490270（1）4（2）1:25（2）1.313370（1）5（3）1:30（3）2.011480（2）4（1）1:30（3）2.278580（2）5（2）1:20（1）1.742680（2）3（3）1:25（2）1.641790（3）5（1）1:25（2）1.579890（3）3（2）1:30（3）1.432990（3）4（3）1:20（1）1.258K14.8145.3474.490K25.6614.4874.533K34.6294.9105.271R1.0320.8600.781ABC根据以上试验结果，直观分析表明：三个因素对多糖提取率的影响大小依次是ABC，即温度对多糖提取率的影响最大，其次是浸提时间，影响最小的是料液比。最佳提取条件是A2B1C3，即使用80，浸提4h，料水比1:30条件下提取。2.3 测定方法稳定性试验精确称取0.5000g的雪莲果粉，经1.2.1和1.2.3.3.1的方法制取待测样品溶液，按1.2.3.3.2方法测定吸光度，每隔30min测定其稳定性。稳定性测定结果见表10。表 10 稳定性试验时间（h）0.51.01.52.0平均含量RSDOD值0.3000.3430.3550.3510.3370.090由上表可知，每隔30min测定一次吸光度，连续2h考察其稳定性，结果RSD为0.090，表明在2h内稳定。2.4 测定方法重现性试验精确称取四份都是0.5000g的同一批原料雪莲果粉样品，经1.2.1和1.2.3.3.1的方法同时制取四份待测样品溶液，按1.2.3.3.2方法测定吸光度，计算雪莲果多糖的含量，检验测定方法的重现性，结果见表11。表11 重现性试验样品编号1234平均含量RSDOD值0.3510.3450.3790.3730.3620.046四份相同材料制成的多糖样品溶液其RSD为0.046，可知其试验结果效果较好。2.5 测定方法的回收率试验（试验结果见表12）表12 回收率试验编号 香蕉皮多糖含量（ug）加入葡萄糖的量（ug）实测值（ug）回收率（%）X （%）RSD（%)178.1640117.2397.67278.1650126.7997.26378.1660136.4597.1597.550.46478.1670146.3597.41578.1680156.7898.27本试验所使用测定方法的平均回收率为97.55%，RSD=0.46%(n=5)，说明该方法测定雪莲果多糖含量具有较高的准确度。2.6 总抗氧化能力测定结果通过1.3.2步骤得到数据进行分析，结果如表13，图5。表13在抗氧化能力测定结果编号123456OD10.0410.0480.0530.0590.0640.067OD20.1090.1850.2580.3300.4010.465总抗氧化能力8.3878.6778.9059.0339.2719.287 图5 在抗氧化能力测定结果由表13和图5可知，香蕉皮多糖还原力较强，且还原能力随着多糖浓度的增加而增大，提示香蕉皮多糖的抗氧化能力随着多糖浓度的增加而增强，且浓度达到一定程度时总抗氧化能力值增加不大。3. 结论3.1本实验对香蕉皮多糖的提取工艺进行研究，探讨浸提时间、料水比及温度对多糖得率的影响，并对香蕉皮多糖的抗氧化活性进行了研究。在单因素试验的基础上，通过正交试验确定最佳提取工艺条件。结果表明：料水比对多糖提取率的影响最大，其次是浸提温度，影响最小的是浸提时间。香蕉皮多糖的最佳提取条件为水浴条件70，浸提时间3h，料水比为1:20条件下提取，香蕉皮多糖提取率为1.6416%。3.2通过对稳定性、重现性和回收率试验来考察方法的科学性和稳定性。经过分析，本方法稳定性RSD为0.75%、重现性RSD为1.41%、平均回收率为99.94%、RSD为0.56%（n=5）。说明采取苯酚硫酸法对香蕉皮多糖进行测定较稳定、准确性好。但因其成分多样、结构复杂，进一步的分离和纯化还待研究。3.3 香蕉皮多糖具有的抗氧化活性使其有望作为天然抗氧化剂和功能性食品而得到开发应用，具有较高的研究开发价值。对于香蕉皮多糖的其他方面如分离纯化、组份鉴定、分子量测定和其他生物活性测定等还有待于今后进一步研究。参考文献1冯长根，吴悟贤，刘霞等 洋葱的化学成分及药理作用研究进展 J. 上海中医药杂志， 2003,37（7）：64-652丘玉昌，吴曙光，徐伟.米糠多糖的提取及其免疫调节作用J.中国生化药物杂志，1999，20（2）：91-933何忠孝主编生物化学实验技术M 化学工业出版社4李如亮生物化学实验 M武汉大学出版社19985郭豫梅野生石参中多糖含量的测定及其抗氧化活性的研究D 2011.66孙文凯，袁怀波，许卫，戚良号 芡实壳提取物抗氧化能力研究J 食品工艺科技 2011.77张赟彬，龚钢明，戴妙妙 甘薯多酚粗提取液的抗氧化活性研究J中国粮油学报，2007，22( 5) :76798陈卫军，曹炜 麦胚提取物的抗氧化性研究J 食品科学，2004，25( 10) :2943009牛付阁，王纪平，王芳，戴成国，段玉峰 覆盆子糖蛋白粗提物体内抗氧化作用研究 J食品工业科技2010.1210董 兰，郑申声，陈昌国 莲心总碱的提取分离及其抗氧化性研究 J 2011.711吕明生，王淑军，徐兴权，盘赛坤，刘 姝，张兆兵 雪莲薯多糖浸提工艺及其对羟自由基清除作用研究 J 食品工业科技 2010.212张强，牟雪姣，周正义，等 洋葱多糖的提取及其抗氧化活性研究J食品与发酵工业，2007，33( 1) :13814113吴晓鹏，王一飞，刘秋英，等 苦丁茶多糖抗氧化活性研究J食品与发酵工业，2008，34( 2) :3436致谢本实验在生物科学与工程学院实验室中完成，在此对帮助过我的系领导、老师说一声：谢谢。本实验是在庞会忠老师的指导下完成实验的，从实验设计方案的设计到实验仪器与设备的整理，从实验理论讲解到实验操作的具体实施乃至具体性的实践，从论文格式的指导到论文具体细节的修改都得到了庞会忠老师的悉心指导和帮助。我被他那一丝不苟的实验态度和精湛的操作技能所折服。在此特别感谢庞会忠老师，他让我在整个实验过程中学到了许多以前未曾学到的专业理论知识和实际操作技能。同时也特别感谢生物科学与工程学院领导对毕业生的大力支持，提供大量经费给我们实际操作的机会。再次表示感谢！袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅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