猪脑心肌病毒（EMCV）的检测反转录聚合酶链反应法（RT-PCR）编制说明.doc

广西地方标准猪脑心肌病毒（EMCV）的检测 反转录聚合酶链反应法（RT-PCR）（征求意见稿）编制说明一、项目背景、来源及目的1、项目背景脑心肌炎是由脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus, EMCV）引起的以脑炎、心肌炎以及心肌周围炎为特征的一种急性传染病。EMCV的宿主谱很广，主要感染啮齿类、猪、灵长类等动物，鼠类是其天然贮存宿主。该病也是一种人畜共患病，不仅给养猪业带来巨大的经济损失，也危害到人类的健康。EMCV感染仔猪可造成心肌等实质器官的广泛病理损伤甚至发生急性死亡，死亡率最高可达100%；可导致怀孕母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍，还可以引起亚临床感染。此病毒最先是1945年从佛罗里达州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩体内分离得到。1985年，巴拿马首次报道EMCV能够感染猪并引起猪急性致死性心肌炎。随后，在意大利、希腊、塞浦路斯、比利时、法国、英国等国也报道了该病的暴发流行。我国于2005年首次从病死仔猪和流产胎儿中分离到EMCV，血清学调查表明，我国规模化猪场已普遍感染EMCV，它已成为危害我国养猪业发展的重要疫病。EMCV是单股正链RNA病毒，属于微RNA病毒科心病毒属的成员。同科的重要猪源病毒包括口蹄疫病毒（FMDV）、猪水疱病病毒(SVDV)、猪捷申病毒(PTV)等，它们在临床上均可导致仔猪的心肌炎或脑炎，与EMCV所致的脑心肌炎难以区分。同时，EMCV所致的繁殖障碍与猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)等导致的繁殖障碍也难以区分。因此，建立和制定EMCV与其它病毒的快速鉴别诊断技术规程，快速、敏感、准确地诊断该病，为正确处置和防控该病，将损失减少到最低限度，对确保我区畜牧业持续、稳定、健康发展具有重要意义。目前，国内检测和诊断猪EMCV仍然没有国家标准或行业标准。2005年以来，我单位承担的广西自然科学基金项目广西猪脑心肌炎病毒的分子流行病学研究（编号：桂科青0732028，主持人：施开创）在建立检测猪EMCV的快速鉴别诊断方法上开展了大量工作，取得较好科技成果，有关建立EMCV real-time RT-PCR检测方法的论文已发表在国家级核心期刊中国兽医科学上、有关建立EMCV RT-PCR检测方法的论文已被国家级核心期刊中国畜牧兽医录用，这些方法已经实验室及临床反复应用，证明具有快速、准确、特异、敏感、高通量、无污染等优点，获得国内同行的认可。2、项目来源本标准为自治区质量技术监督局下达广西动物疫病预防控制中心承担的2010年第二批广西地方标准制定（修订）计划任务项目（桂质监函2010342号），编号为2010-2036。3、项目目的目前，国内检测和诊断猪脑心肌炎病毒的方法，主要包括病原分离鉴定、病毒中和试验、ELISA方法和RT-PCR方法等，但尚无国家标准和行业标准。由于RT-PCR检测方法快速、准确、敏感、操作较简便，易标准化，多数基层单位均具备开展条件，易于推广应用。因此本项目尝试编写检测EMCV的推荐性地方标准，内容涵盖应用RT-PCR检测EMCV的材料准备、操作方法及结果判定等。二、工作概况从2007年5月开始，我单位承担了广西自然科学基金项目广西猪脑心肌炎病毒的分子流行病学研究。课题组在EMCV的快速鉴别诊断方法上开展了大量研究工作，取得较好成果。根据国内检测和诊断猪EMCV尚无国家标准或行业标准的实际，课题组开展了相关资料的收集整理工作，确定标准编写目标和依据，同时起草制（修）订广西地方标准项目建议书，积极开展标准的申报。2010年5月下旬接到自治区质量技术监督局下达的地方标准制定（修订）项目计划的通知后，迅速成立标准编制课题组，确定标准起草编写方案及时间进度表，并积极组织实施。至6月30日已完成标准初稿的编写。至7月30日完成测试和验证工作。8月15日已按GB/T 1.1-2009标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则要求完成标准征求意见稿的编写工作。经过课题组全体成员反复研讨、修改和校对，形成本标准征求意见稿。本标准编制课题组人员包括：施开创、郑 敏、莫胜兰、胡 杰、屈素洁、李 军、刘 棋。具体分工如下：施开创：组长、主持人。负责标准的提出、起草、验证、审定、申报。郑 敏：副组长。负责组织标准的起草、修改、实验室及临床验证。莫胜兰：负责标准的起草、校正、外联。胡 杰：负责标准的实验室及临床验证。屈素洁：负责标准的实验室及临床验证。李 军：负责组织标准的修改、审核、申报。刘 棋：负责组织标准的起草、审定、申报。三、标准编制原则1、政策性原则：本标准编写过程遵循国家相关法律、法规和国家标准。2、先进性原则：以国内外相关文献资料为参考，力求反映最新的科技成果；以国内同类标准的编写方法为基础，对本标准进行规范、充实和创新，使之具有先进性。3、经济性原则：本项目为自筹经费项目，因此在本标准编制过程，从获取信息、起草、实验室和临床验证到形成征求意见稿的每一个环节，在确保质量的前提下均力行节约，利用有限的经费圆满完成各阶段编写任务。4、适用性原则：本标准集国内外EMCV RT-PCR检测技术的成功经验，并经实验室和临床验证，且完全按照国家标准的要求编写，内容全面，形式规范，可操作和实用性强。5、协调统一性原则：本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方法，力求与国内相关标准的协调统一。本标准通过持续查新，确保内容不与已有的国家标准、行业标准和地方标准重复或相矛盾。6、规范化原则：本标准是严格按照GB/T 1.1-2009的要求来编写的。四、标准主要内容及依据本标准是动物疫病防控地方标准，标准编写的重点是疫病的检测。标准的主要依据是借鉴国内先进的标准和技术内容，参考国内外有关文献资料，结合我国国情，进行实践研究，并通过试验和验证后，并参考其他资料经室内、室间验证提出。标准编写的主要内容包括样品的采集、样品的处理、RT-PCR操作过程以及结果的判定，适合于EMCV RT-PCR检测。标准的建立过程主要进行了以下试验：1、试剂和材料（1）主要试剂1 mol/L PBS（PH7.2）缓冲液Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0（包含RNA抽提所需的除1 %冰乙酸异丙醇以外的全部试剂）Quant 一步法 RT-PCR 试剂盒（包含了RT-PCR扩增所需全部成份）（2）毒株和RT-PCR引物序列分别见表1和表2。表1 试验用毒株及其来源毒株名称来源 BJC3农业部人畜共患病重点开放实验室杨汉春教授提供表2 引物序列及扩增片段长度引物名称特异性引物的核苷酸序列扩增片段长度（bp）3DF5-GGTGAGAGCAAGCCTCGCAAAGACAG-32863DR5-CCCTACCTCACGGAATGGGGCAAAG-3（3）样品广西动物疫病预防控制中心从2008年3月至2010年5月从南宁、玉林、柳州、贵港4市共收集了207例疑似脑心肌炎发病仔猪心、脑、脾脏、淋巴结等组织。 2、方法（1）传代BHK细胞的制备选用生长良好的无EMCV污染的BHK-21健康细胞，加入原生长液量1/10的EDTA-胰酶分散液，消化3 min5 min，待细胞呈雪花状时，倒去分散液。先用少许生长液吹打细胞，然后按1:5的分种率，补足生长液。混匀、分装，于5 CO2、37 温箱静置培养。待BHK-21细胞生长成70 %80 %单层时，吸弃生长液，按10 %的比例接种制备好的病料上清，同时接种同样体积的PBS作为阴性对照组，37 吸附1 h后补足细胞维持液培养。每隔12 h观察一次细胞的生长状况，当70 %的细胞出现CPE或接种36 h后收毒。（2）病毒含量测定采用96孔细胞培养板，按常规用Reed-Muench法测定病毒的TCID50。（3）RT- PCR1）样品前处理无菌采取2 g待检猪的心、脑、脾脏、淋巴结等组织，置于乳钵或玻璃研磨器中，加入少量灭菌石英砂和4 mL灭菌的1 mol/L PBS（PH7.2）充分研磨，使其成为匀浆，收集组织悬液，反复冻融3次。以3 000 g离心5 min，收集上清液。上清液用于总RNA抽提，或者20 保存备用。收获感染EMCV的单层细胞培养物，反复冻融3次。以1 000 g离心5 min，收集上清液，供总RNA抽提，或者20 保存备用。2）待检样品总RNA提取取处理过的待检样品上清200 L置于无RNA酶的1.5 mL离心管中，加入200 L Solution A，剧烈震荡混匀，室温放置5 min；加入75 L Solution B，轻柔混匀后，12 000 r/min 4 离心5 min。将上述操作的上清液转移至新的离心管中，加入250 L含1 %冰乙酸的异丙醇，混匀。将试剂盒中的Spin column安置于2 mL的离心管中。将混合液转移至Spin column中，12 000 r/min 4 离心1 min，弃滤液。将500 L的Rinse A加入到Spin column中，12 000 r/min 4 离心1 min，弃滤液。再将500 L的Rinse B，加入到Spin column中，12 000 r/min 4离心1 min，弃滤液。重复用Rinse B再洗涤一次Spin colum。将Spin column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin column膜的中央处加入30 L的Elution Buffer，室温静置1 min。12 000 r/min 4 离心1 min洗脱病毒RNA。取3 L5 L总RNA样品进行RT-PCR，或-20保存备用3）RT- PCR反应体系在冰浴条件下，按下表中各试剂用量在PCR反应管中分别加入各成分：试剂名称用量终浓度10 RT-PCR Buffer2.5 L1 倍5 RT Enhancer Buffer5 L1 倍dNTP Mixture（10 Mm each）1 L0.4 mmol/LRnasin（40 U/L）0.25 L0.4 U/LHotmaster Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1.25 L0.125 U/LQuant RTase（for one step）0.25 LEMCV 上下游引物（25pmol/L）各1 L1 pmol/L待检总RNA模板3 L5 L灭菌双蒸水补足至总体积为25 L4）PCR反应程序将加有试剂的PCR反应管进行瞬时离心混匀后置于PCR仪内，按如下程序进行反应： 50 ，30 min； 94 ，2 min； 94 ，30 s； 56 ，30 s，65 ，30 s； 循环30次； 65 ，8 min； 4 结束反应。PCR产物保存于4 冰箱以备电泳。5）特异性试验分别用该方法对口蹄疫病毒（FMDV）、猪水疱病病毒(SVDV)、猪捷申病毒(PTV)等、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)等阳性猪病料提取RNA或DNA进行RT-PCR扩增，检验方法的特异性。6）敏感性试验将培养并测定含量的EMCV细胞毒液分别做10倍系列稀释，取200 L细胞毒稀释液提取总RNA，以此为模板进行RT-PCR，根据其能检测的最大稀释度判定RT-PCR的最小检出量。7）实际样品检测对广西动物疫病预防控制中心收集、保存的207份历年猪心、脑、脾脏、淋巴结等组织病料，4份健康猪心脑组织样品，3份EMCV病毒细胞培养物进行检测，以验证该方法检测临床样品的可行性。3、结果（1）特异性试验结果如图1所示，EMCV扩增产物在286 bp处有特异性条带，而阴性对照、口蹄疫病毒（FMDV）、猪水疱病病毒(SVDV)、猪捷申病病毒(PTV)等、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)等病毒的临床阳性病料扩增产物均无286 bp特异性条带出现。结果证明该RT-PCR方法具有良好的特异性。（2）敏感性试验结果将已知病毒含量为106 TCID50/mL的EMCV分别做10倍系列稀释，直到稀释液中最低病毒含量为1 TCID50/mL，取200 L稀释液提取总RNA进行RT-PCR，扩增产物电泳结果显示，病毒含量为100 TCID50/mL的样品仍可检测到预期大小为286 bp的目的片段，表明该检测方法的敏感性为100 TCID50/ mL病毒，见图2。（3）田间样品检测结果利用已建立的RT-PCR方法对广西区动物疫病预防控制中心收集的207份猪心、脑、脾脏、淋巴结等组织病料，4份健康猪组织样品，3份EMCV细胞培养物进行检测。结果207份猪组织样品中有29份为EMCV阳性；而4份健康猪组织样品以及剩余178份组织样品的检测结果均为阴性，EMCV阳性细胞培养物检测结果与预期完全相符，见图3。图1 RT-PCR特异性试验结果M：DNA Marker DL2 000；1：EMCV阳性细胞培养物；2：阴性对照；3：FMDV；4：SVDV；5：PTV；6：PRRSV；7：PPV ；8：PRV；9：CSFV； 图2 RT-PCR敏感性检测结果M：DNA Marker DL2 000；1：105 TCID50 ；3：104 TCID50；4：103 TCID50；5：102 TCID50；6：10 TCID50；7：1 TCID50； 图3 RT-PCR对部分临床样品的检测结果M：DNA Marker DL2 000；1：EMCV阳性细胞培养物 ；2：阴性对照；315：临床样品，其中4、5、6、7、9、10、11号样品检测结果阳性，3、8、12、13、14、1