细胞免疫的检测（小鼠淋巴细胞外周血单核细胞的分离）.doc

细胞免疫检测（小鼠淋巴细胞/外周血单核细胞的分离）1. 材料脾细胞分离：75%酒精，瓶皿，镊子/剪刀（数套），RPMI-1640，灭活血清，8.3 g/l NH4Cl，匀浆器，15 ml离心管，EP管，枪头，细胞计数板，擦镜纸，台盼蓝，吸管。细胞因子的定量RT-PCR检测：RNA提取相关试剂及耗材，反转试剂盒，SYBGREEN，枪头，DEPC水。细胞因子的ELISA检测：详细阅读说明书，严格按要求操作。2. 脾细胞分离的具体步骤： （1）处死的小鼠置75%酒精中浸泡35 min，全身消毒灭菌。（2）取出小鼠，放置于泡沫板右侧卧固定，剪开左侧背腹交界处皮肤，即可见到脾脏，分三套镊子/剪刀取脾脏：第一套：剪开皮肤第二套：剪开皮肤下的各种膜组织第三套：剪开取脾 每5-8只小鼠换一次平皿、镊子/剪刀，以防循环操作过程中的污染（3）无菌取出脾脏，置盛有不完全RPMI-1640的平皿中清洗后，转入无菌匀浆器中，加少许不完全1640，轻轻研磨。（4）补加不完全RPMI-1640混匀，竖直静放23 min，使脾脏组织块下沉。（5）轻轻吸取上清液入15 ml离心管中，1000 rpm离心10 min。（6）弃上清，加入5 ml无菌的8.3g/l NH4Cl，静止5 min（去除红细胞），1000 rpm离心10 min。（7）弃上清，用不完全RPMI-1640洗涤，1000 rpm离心10 min。（8）弃上清，沉淀用完全2.5 ml RPMI-1640（含10% FBS）悬浮。（9）细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95%以上。（9）调整浓度为4106 cells/ml。整过程的原则速度要快，以长时间的操作导致细胞活性下降以及大量死细胞的产生；防污染。外周血单核细胞的分离：（1）无菌采集猪前腔静脉血5 ml，立即注入含有适量抗凝剂（肝素钠或枸橼酸钠）的无菌小瓶中，加盖后轻摇匀，使血液抗凝。（2）再加入含3%血清的PBS（可降低红细胞的凝聚，提高分离效果），等体积稀释。（3）吸取3 ml淋巴细胞分层液于无菌的15 ml离心管中，然后将离心管斜45度角，于距分层液界面上1.0 cm处沿管壁缓慢加入抗凝血（注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内）。（4）2000 rpm 离心30 min，管内可分为四层（从上至下）：第一层：血浆及大部分血小板第二层：灰白色，为淋巴细胞层和单核细胞层第三层：分层液第四层：红细胞及粒细胞（5）无菌吸取单核细胞层加入另一离心管中，所得到的PBMC悬液用5倍体积的PBS重悬，1000 rpm离心10 min，以去除大部分混杂的血小板。（6）用红细胞裂解液悬浮细胞沉淀，室温静置5 min（去除红细胞）, 1000 rpm离心5 min。（7）用PBS洗再洗一次。（8）沉淀用完全RPMI-1640（含10% FBS）悬浮。（9）细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95%以上。（9）调整浓度为4106 cells/ml。3细胞因子的定量RT-PCR检测（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4106 cells/ml的细胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。（2）置37 ，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并测定 RNA浓度和纯度。（3）取0.5 g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。（4）定量PCR：Primer-Forward（IFN-/IL-4/-actin）1 l（10 M）Primer-Reverse（IFN-/IL-4/-actin）1 l（10 M）2SYBR Green Real-time PCR Master Mix12.5 lcDNA1 lROX0.05 lH2O9.45 l总25 L反应扩增条件为：95 C预变性1 min；紧接着40个循环的94 C变性15 s，60 C退火30 sec，72C延伸45 sec。分析结果。4细胞因子的ELISA检测：（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4106 cells/ml的细胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。（2）置37 ，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 有些文献报道48 h即可检测对细胞因子进行ELISA检测，但经过比较发现，72 h检测时的效果更好。（3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不同），严格按要求操作。标准曲线是判定实验的质量。5淋巴细胞增殖实验（MTT法）MTT是一种噻唑盐，为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，生成蓝色的甲臜（Formazan）结晶。T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)和刀豆蛋白A(ConA)作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS）则刺激B细胞发生增殖。小鼠脾淋巴细胞发生增殖后，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经DMSO溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长OD490 nm or 570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度（1）于96孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为2106 cells/ml的细胞悬液加至各孔内，每孔100 l，三个复孔。同时设置阳性对照孔（phytohemagglutinin or ConA，10 g/ml)）和阴性对照孔（medium alone）。（2）置37 ，5 % CO2温箱中培养72 h。（3）每孔加20 l MTT (5 mg/ml in PBS)，37 ，5 % CO2温箱中放置4 h。（4）将板子以2000 rpm离心15 min，小心吸弃孔内上清液。（5）每孔加150 l DMSO以溶解甲臜（Formazan）颗粒沉积，振荡10 min，使结晶物充分溶解。（6）选择OD490 nm or OD570 nm波长，读数。注意事项：（1）选择适当的细胞接种浓度。（2）MTT粉末和溶液保存时都需避光，实验时一般关闭超净台上的日光灯（3）避免血清干扰，在呈色后尽量吸尽孔内残余培养基。新的商品化检测法