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TNFAIP3的功能性基因遗传变异影响中国汉族人群系统性红斑狼疮易感性的研究 分分类号Q987.2单位代码10183研究生学号xx342052密级公开吉林大学硕士学位论文（学术学位）TNFAIP3的功能性基因遗传变异影响中国汉族人群系统性红斑狼疮易感性的研究Functional variantsof TNFAIP3are associated with systemiclupus erythematosusin acohort ofChinese Han population作作者姓名张研专专业生物化学与分子生物学研研究方向遗传学指指导教师赵志壮教授培培养单位生命科学学院2019年5月TNFAIP3的功能性基因遗传变异影响中国汉族人群系统性红斑狼疮易感性的研究Functional variantsof TNFAIP3are associated with systemiclupus erythematosusin acohort ofChinese Hanpopulation作者姓名张研专业名称生物化学与分子生物学指导教师赵志壮教授学位类别理学硕士答辩日期年月日吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名日期年月日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解吉林大学有关保留、使用学位论文的规定，同意吉林大学保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权吉林大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 论文级别硕士博士学科专业生物化学与分子生物学论文题目TNFAIP3的功能性基因遗传变异影响中国汉族人群系统性红斑狼疮易感性的研究作者签名指导教师签名年月日作者联系地址（邮编）吉林省长春市吉林大学前卫南区 （130012）作者联系电中文摘要系统性红斑狼疮（Systemic lupuserythematosus,SLE），是一种自身免疫疾病，其特征在于自身产生反应性抗体，导致全身性炎症和器官衰竭（在自身反应性抗体的作用下，能导致全身性炎症和器官衰竭的疾病）。 肿瘤坏死因子诱导蛋白3（Tumor necrosisfactor alpha-induced protein3,TNFAIP3）存在于免疫系统的多种细胞类型中，能够通过去泛素化作用特异性抑制核转录因子NF-B（Nuclear factorkappa-B）信号通路。 早前的研究证实，在欧洲和韩国人群的系统性红斑狼疮患者中，TNFAIP3存在成对的多态性二核苷酸rs 148314165、rsxx20567变异，合称TTA，与SLE易感性呈现显著的关联性。 但TTA突变在中国汉族人群中是否存在以及与SLE的易感性关联尚不清楚。 本课题旨在探究中国北方汉族人群中TNFAIP3基因的突变与SLE易感性的关联程度，并且进一步研究SLE对TNFAIP3与NF-B的mRNA表达的影响。 实验方法如下我们调查了1229例中国汉族人群的SLE患者和1608例与之匹配的健康对照，通过Sanger Sequencing技术、TaqMan探针技术对他们的突变位点rs 148314165、rsxx20567进行基因分型，再通过连锁不平衡分析得到这两个突变的基因分型结果，检测其与SLE易感性的关联程度。 应用实时定量PCR技术，检测样本中外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中TNFAIP3和NF-B基因的mRNA表达，探讨其突变位点多态性之间的关联。 我们还进一步探究了中国汉族人群中，TNFAIP3外显子3的编码区变异SNP rs2230926与功能性变异TTA的遗传关联。 通过获取中国汉族SLE患者的PBMC，评估上述两种变异在调节TNFAIP3基因表达水平和NF-B信号通路中的作用。 实验结果显示，在中国北方汉族的SLE群体中，TTA变异和TNFAIP3的SNP rs2230926都展示出显著的关联性（P TTA=8.9610-12，odds ratioOR=2.07，95%confidence intervalCI=1.68-2.55）。 携带风险A等位基因的SLE患者TNFAIP3基因mRNA的表达降低，PBMC中NF-B1表达增加。 Conditional assays显示TTA变异可能是中国汉族人群SLE患者的功能性变异。 结果表明TTA II变异与中国汉族人群SLE的易感性具有关联并且可能与TNFAIP3基因的表达呈负相关，与NF-B信号通路的活性呈正相关。 系统性红斑狼疮具有多种临床表现，症状程度因人而异，涉及许多不同的器官和组织，包括器官特异性自身抗体的产生，干扰素通路活性的失调，以及靶器官如肾、脑、皮肤等免疫复合物介导的炎症反应2。 常见症状包括关节疼痛和肿胀，发烧，胸痛，脱发，口腔溃疡，淋巴结肿大，疲倦，以及最常见的脸上的红色皮疹3,4。 女性患者往往具有白细胞计数低、关节炎、雷诺综合征和精神症状；男性往往有更多的癫痫发作、肾脏疾病、浆膜炎、皮肤问题和神经病变5。 该疾病通常有发病周期以及缓解期，在缓解期期间症状较少。 SLE的发病率因国家，种族和性别而异，并随时间而变化6。 全球范围内，每10万人中有20至70人患病6。 育龄妇女的受影响程度是男性的9倍7。 患病虽然最常见于15至45岁之间，但实际上各种年龄段都会受到影响。 非洲，加勒比地区和中国都是患病风险较高的地区。 对于很多发展中国家的疾病发病率尚无清晰研究6,8。 流行病学研究表明，系统性红斑狼疮在每个种族内和年龄段，女性相较男性都具有更高的发病率，在中年达到发病的峰值，男性的发病顶峰较晚。 在中国，系统性红斑狼疮的发病率为0.03%，并且正呈现流行趋势9。 系统性红斑狼疮目前仍然不可治愈9，对医疗和疾病研究也产生了越来越严峻的考验。 1.1.2系统性红斑狼疮的诊断SLE没有治愈方法，但有很多治疗方法可以治疗这种疾病。 在20世纪50年代，大多数被诊断患有SLE的人存活不超过五年。 如今，超过90的人现在存活了十多年，许多人生活中相对不出现症状。 80-90的人可以过上正常的生活。 然而，与没有SLE的人相比，患者的累积死亡率依然很高10。 SLE的诊断第1章前言2目前仍然很困难，并且需要基于症状和实验室检查。 SLE的诊断主要不仅依靠临床表现界定、还必须依赖实验室的免疫检查，此外，还有可能借助组织病理学和影像学的帮助来做准确的诊断10。 目前SLE的症状诊断遵循美国风湿病学会（ACR）于1982年制定的11项标准（并于1997年修订，如表1.1），作为在临床试验中实施SLE定义的分类工具11。 而在实验室检测中应用最广泛的方法是免疫荧光法。 免疫荧光可以检测人体皮肤中免疫球蛋白和补体蛋白的沉积8。 当测试样本是未暴露在阳光下的皮肤时，并且荧光出现阳性结果，则可证实该样本患有系统性红斑狼疮11。 由于SLE能够对人体造成多系统的损伤，因此在医学检测上很多项能够帮助确诊。 例如当血液系统异常或者存在肾脏损伤时，通过血常规检查会经常出现贫血、白细胞量减少、血小板降低等症状；当肾脏被攻击，检测结果则会出现蛋白尿、血尿4。 此外，红斑狼疮还有更多的变形以及其他的类型，例如盘状红斑狼疮、相对罕见的新生儿狼疮以及亚急性皮肤红斑狼疮12。 表1.1ACR1997年SLE分类标准1颊部红斑两颧突出部位有固定红斑2盘状红斑片状高起于皮肤红斑，或萎缩性瘢痕3光过敏对日光有明显反应，引起皮疹4口、鼻腔溃疡无痛性的口腔或鼻咽部溃疡5关节炎非侵蚀性关节炎，外周关节有压痛、肿胀或积液6浆膜炎胸膜炎或心包炎7肾脏病变尿蛋白定量（24h）0.5g或+8神经病变癫痫发作或精神病9血液学疾病溶血性贫血、或白细胞减少、或淋巴细胞减少等10免疫学异常抗dsDNA抗体阳性，抗Sm抗体阳性，或抗磷脂抗体阳性11抗核抗体抗核抗体滴度异常该分类标准的11项中，符合4项或4项以上者，在除外感染、肿瘤和其他结缔组织病后，可诊断SLE。 1.1.3系统性红斑狼疮的研究现状目前有大量研究显示SLE发病主要与遗传因素和环境因素有关，另外内分泌紊乱、免疫系统感染同样与SLE的发病相关联7。 最近的几项研究表明，SLE的发病率正在增加。 女性与男性的比例从4.3到13.6不等6。 SLE在非洲裔美国第1章前言3人，非洲裔加勒比人和亚洲人中比在高加索人中更常见。 非洲裔美国人普遍的诊断年龄比高加索人年轻13。 20世纪80年代，明显提高的生存率也趋于平稳；但20年生存率仅为53-61。 虽然现如今SLE已经可以得到控制，但患病人群死亡率依然是不患病人群的3倍14。 从遗传学角度研究发现，在同卵双胞胎中，如果一个人受到影响，另一个人也有24的可能性患病7。 家庭疾病发病率的遗传学研究也证实这种疾病的遗传基础，它的遗传率大于6615。 与兄弟、异卵双胞胎和其他兄弟姐妹相比，同卵双胞胎对疾病的易感性大于3516。 SLE被证实具有家族遗传特点，但没有发现单一的因果基因。 相反，当环境因素触发时，会有多个基因影响一个人患上SLE的风险。 一些易感基因可能是具有群体特异性的17。 药物诱发的系统性红斑狼疮是一种可逆性疾病，一旦引发发作的药物停止使用，药物诱导的狼疮的症状通常也会消失14。 超过38种药物可引起这种情况，其中最常见的是普鲁卡因胺，异烟肼，肼苯哒嗪，奎尼丁和苯妥英等14。 同时女性性激素，日照，吸烟，维生素D缺乏和某些感染也被认为会增加患病风险。 在上述多种可能的因素多方影响下，SLE在体液免疫系统中致使患者外周免疫器官中T淋巴细胞减少，B淋巴细胞分化增多并识别自身抗原，导致自身抗体大规模产生，免疫复合物攻击自身的组织和器官18。 免疫复合物激活补体，后者介导免疫应答，引起急慢性炎症；在更严重的症状下造成组织坏死（如狼疮肾炎）13。 而在细胞免疫系统中，自身抗体直接识别组织细胞为抗原，引起细胞破坏，影响细胞的既定功能，并进一步造成机体的多系统损伤。 SLE患病机制涉及针对自身组织的自身抗体的免疫应答13。 1.1.4系统性红斑狼疮的治疗方案SLE的病患病情个体差异很大，因此在治疗方面，必须根据病人情况而异。 在发病期应避免感染等诱发因素，建立精神和心里层面的治疗，并避免日晒，建议多卧床休息，适度锻炼身体，等到病情稳定可酌情恢复工作19。 目前使用的药物治疗有以下几种 （1）非甾体类抗炎药（NSAIDs），过去曾使用泼尼松，霉酚酸和他克莫司等药物，但非甾体类抗炎药会在神经系统，血液系统及心血管系统产生副作用； （2）改善疾病的抗风湿药物（DMARDs），预防性使用以减少发作的发生率，通常使用的DMARD是抗疟药，例如羟氯喹。 羟氯喹是FDA第1章前言4批准的抗疟药，用于体质，皮肤和关节表现。 羟氯喹的副作用相对较少，有证据表明它可以提高患有SLE的人的生存率； （3）糖皮质激素，主要是皮质类固醇，要根据病人情况设计剂型剂量，需要类固醇参与治疗的人可能会出现库欣综合症，其症状可能包括肥胖，脸部浮肿，糖尿病，食欲增加，睡眠困难和骨质疏松症； （4）免疫抑制剂，在更严重的情况下，调节免疫系统的免疫抑制剂也被用于控制疾病并预防症状复发。 如果服药初始剂量少，这些副作用可能会消退，但即使是低剂量的长期使用也会导致血压升高和白内障。 许多新的免疫抑制药物正在积极测试SLE。 它们不是像皮质类固醇那样非特异性地抑制免疫系统，而是针对个体免疫细胞的类型。 其中一些药物已经获得FDA批准用于治疗类风湿性关节炎； （5）镇痛类药物，由于大部分患有SLE的人患有不同程度的慢性疼痛，如果非处方药不能提供有效的缓解，则可以使用更强的处方镇痛药。 疼痛通常用阿片类药物治疗。 当阿片类药物长期使用时，可能会出现药物耐受性，化学依赖性和成瘾性。 （6）静脉注射免疫球蛋白（IVIGs）可用于控制器官受损或血管炎症的SLE。 据早前的研究，它们减少了抗体产生或促进免疫复合物从体内清除，即使它们的作用机制尚不清楚。 与免疫抑制剂和皮质类固醇不同，IVIGs不会抑制免疫系统，因此这些药物严重感染的风险较小。 （7）其他药物，值得一提的是，当SLE中的症状发展成狼疮肾炎，某些类型的狼疮性肾炎如弥漫增生性肾小球肾炎需要间歇性细胞毒性药物。 这些药物包括环磷酰胺和霉酚酸酯。 环磷酰胺用于严重的肾小球肾炎或其他器官损害性并发症，也用于治疗狼疮性肾炎，但它没有获得FDA批准用于该适应症。 SLE目前的控制药物，适宜人群和毒副作用如表1.2所示。 FDA正在调查有关孕妇孕期使用时可能与新生儿缺陷有关的报道。 最后，虽然大多数患有SLE的母亲所生的婴儿都是健康的，但患有SLE的孕妇应该在分娩前继续接受医疗护理。 新生儿狼疮是罕见的，但鉴定出并发症风险最高的母亲可以在出生前或出生后立即进行治疗。 此外，SLE可以在怀孕期间爆发，适当的治疗可以更长时间地维持母亲的健康。 对于患有SLE的女性，通常建议采用避孕和其他可靠的预防妊娠形式。 第1章前言5表1.2SLE现有药物、适宜人群与副作用药物种类适宜人群毒副作用1非甾体类抗炎药低热、关节症状、皮疹和心包及胸膜炎的患者在神经系统，血液系统及心血管系统产生副作用2抗风湿药物皮疹、低热、关节炎、轻度胸膜炎和心包炎、轻度贫血和血白细胞计数减少的患者心脏传导障碍和视网膜色素沉着3糖皮质激素根据病人具体情况设计剂型剂量肥胖，脸部浮肿，糖尿病，食欲增加，睡眠困难和骨质疏松症4免疫抑制剂目前有多种抑制剂适合不同症状的患者肝脏损害、出血性膀胱炎、过敏反应等5镇痛类药物伴有处方药不能一直的疼痛患者药物耐受性，化学依赖性和成瘾性6免疫球蛋白重症患者副作用较小、引发感染风险小7细胞毒性药物肾小球肾炎或其他器官损害性并发症尚未获得FDA批准综上所述，目前的治疗包括NSAIDs，皮质类固醇，免疫抑制剂，羟氯喹和甲氨蝶呤等。 但SLE患者的预期寿命依然较低20。 SLE显著增加心血管疾病的风险，这也成为患者最常见的死因。 SLE的病因尚无明确理论，大量研究显示发病最主要是与遗传因素相关，此外，不同人群的环境因素也可以影响SLE的发病概率；内分泌紊乱、免疫系统感染等等也与SLE的发病相关联7。 通过现代治疗，约80的受影响者存活超过15年。 患有狼疮的妇女怀孕风险较高但大多数都是成功的。 现今SLE患者常采取广谱免疫抑制剂治疗，但这些药物的副作用反而导致了相当大的发病率和累积死亡率21。 医学领域常规的治疗和诊断目前已经无法取得突出效果，鉴于SLE的发病很大一定程度上遗传因素22，所以对于系统性红斑狼疮，从遗传角度研究发病的人群特点并且对规律进行更细致的分析显得极为重要，尝试从基因层面了解SLE的发病机制更为迫切。 因此，更好地了解SLE发病的遗传机制，将在未来推进系统性红斑狼疮的诊断和治疗的进展。 第1章前言61.2疾病遗传性研究方法1.2.1基因与疾病遗传易感性研究的重要标记单核苷酸多态性作为生物遗传学上的重要分子标记，单核苷酸多态性（Single nucleotidepolymorphism，SNP），可以应用于基因与疾病遗传易感性研究，为进一步探索疾病的发病机制提供关键性线索。 SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异（包括单个核苷酸的转换、颠换、缺失和插入）所引起的一种DNA序列多态性。 SNP通常指的是突变频率大于1%的变异，在人类基因组中，SNP广泛存在，平均每1000个碱基就对应一个SNP，SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上，同时也是基因组中最为稳定的变异。 因此，SNP逐渐成为研究不同疾病的遗传背景的标记，人体许多可遗传的表型差异、对药物的耐受特性或疾病的易感性等等都可以通过SNP的研究获得结论。 SNP在基因中，既可以存在于编码序列，也可以在非编码序列区域，或在基因间区域。 由于遗传密码的简并性，蛋白质的氨基酸序列不一定能由编码序列内SNP的改变而改变。 编码区中的SNP有两种类型同义和非同义SNP。 其中，同义SNP不影响蛋白质序列，而非同义SNP改变蛋白质的氨基酸序列。 即便能改变氨基酸序列，功能却未必发生改变，因为非同义SNP有两种类型错义和无意义。 不在蛋白质编码区中的SNP，仍可能影响基因剪接，转录因子结合，信使RNA降解或非编码RNA序列，错义即改变蛋白质功能的SNP，无意义即虽然改变蛋白质氨基酸序列，但对其生物功能没有产生影响。 基因组的SNP存在微小的变异以及许多相对较大的变异，例如缺失，插入和拷贝数变异。 这些中的任何一种都可能导致个体特征或表型的改变，其可以是从疾病风险到诸如身高的物理特性的任何事物。 1.2.2疾病遗传性研究的方法全基因组关联研究SNP在生物医学研究中的重要性在于能在全基因组关联研究中（Genome-wide associationstudies，GWAS）比较群组之间的基因组区域。 在2000年左右，在引入GWAS之前，主要的调查方法仍然是通过家族遗传连锁的遗传研究。 事实证明，尽管这种方法对单基因疾病非常有用，然而，对于常见和复杂第1章前言7的疾病，遗传连锁研究就难以实现。 连锁研究的建议替代方案是遗传关联研究23。 除了概念框架之外，还有一些其他因素促成了GWAS。 其一就是生物库的出现，这是人类遗传物质的储存库，极大降低了收集足够数量的生物标本，并进行研究的成本和难度。 另一个是国际HapMap项目，该项目从xx年开始确定GWAS中查询的大多数常见SNP。 此外，使用基因分型对所有这些SNP进行基因分型的方法的开发是一个重要的发展进程。 GWAS分析的方法有很多（如图1.1），最常见的方法是病例对照研究，它比较两个大群体的个体，一个健康对照组和一个受疾病影响的病例组。 对于大多数常见的已知SNP，对每组中的所有个体进行基因分型。 对于这些SNP中的每一个，然后研究在病例和对照组之间等位基因频率是否显著改变。 在这种设置中，报告效果的基本单位是比值比，计算通常使用生物信息学软件完成。 优势比是在GWAS的背景下，具有特定等位基因的个体的疾病几率和没有相同等位基因的个体的疾病几率这两个概率的比率。 当病例组中的等位基因频率远高于对照组时，优势比高于1。 另外，通常使用简单的卡方检验来计算优势比的显著性的P值。 发现与1显著不同的优势比是GWAS的目标，因为这表明SNP与疾病相关23。 GWAS在中国针对遗传性疾病的研究是广泛的，首先，因为中国人口基数大，以家庭为结构可以更好地研究遗传性疾病；其次，中国科学家在人类基因组计划、HapMap项目和千人基因计划中有着突出贡献，并在这些国际合作中促进了GWAS在中国的应用，因此，选择GWAS作为研究中国汉族SLE患者的遗传关联。 在全球范围内，GWAS已经识别出40多个与SLE相关联的位点（如图1.2）24，其中很多位点已经在中国患者人群中被证实存在（如表1.3所示），并涉及一系列广泛的生物途径24。 然而对于这些位点的大多数，他们的变异与SLE的关联性仍待揭晓。 SNP已经在GWAS中被用作与疾病或正常性状相关的基因作图中的高分辨率标记。 在表型层面，因为它们的数量和代代相传的稳定遗传，没有可见影响的SNP，即所谓的沉默突变，仍然可用作全基因组关联研究中的遗传标记。 因此SNP能成为我们能够进一步阐明SLE发病的遗传机制提供重要线索。 第1章前言8图1.1GWAS分析的不同方案图1.2染色体上与SLE相关联位点示意图，引自Yong Cui.Journal ofAutoimmunity (xx)第1章前言9表1.3通过GWAS分析得出的中国SLE患者的相关基因及位点CHR GENE SNPs CHRGENESNPs1q25.1TNFSF4rs10798269-C10q11.23WDFY4rs7097397-G rs2205960-A rs1913517-A2p22.3RasGRP3rs13385731-A11q23.3NR rs4639966-G2q32.3STAT4rs7574865-A11q24.3ETS1rs1128334-A5q33.1TNIP1rs10036748-A rs6590330-A6p21.32-33HLA-DRB1rs9271100-A12q24.33SLC15A4rs1385374-A6q21ATG5rs548234-G rs10847697-A6p21UHRF1BP1rs13205210-C13q14.11ELF1rs7329174-G6q23.3TNFAIP3rs2230926-C16p11.2NR rs7186852-A7p12.2IKZF1rs4917014-A rs7197475-A7q11.23NR rs1167796-G PRKCBrs16972959-G7q32.1IRF5-TNPO3rs4728142-A16p13CLEC16A rs12599402-A8p23.1BLK rs7812879-G22q11.21UBE2L3rs131654-A近年正在被广泛使用的全基因组关联研究、基因组技术和分析工具的进步推动了SNP与人类多种具有遗传特征的疾病和自身免疫病之间的联系，基于这些研究进展SNP也成为本实验对SLE的易感性研究的有力工具。 系统性红斑狼疮作为典型的自身免疫病，受到遗传因素和环境因素的综合影响。 从疾病的遗传角度来看，近年来，学术界越来越多地运用全基因组关联研究GWAS来对遗传性疾病进行定量分析，因此GWAS成为了研究SLE遗传机制的重要方法。 在遗传学中，GWAS是对不同个体的基因组范围的遗传变异集的观察性研究。 GWAS通常关注SNP与主要人类疾病等性状之间的关联，但同样可以应用于任何其他遗传变异体和任何其他生物体。 随着高通量分型技术的发展，我们可以实现对全基因组上的突变的扫描，利用数据分析一个SNP等位基因的变异对疾病的易感性或其发生和遗传的影响，筛选出与疾病易感性相关的各个SNP位点，并基于基因组中SNP基因座的位置和连锁不平衡分析（linkage disequilibrium,LD），估计该疾病的易感基因，并验证该基因与疾病易感性之间的相关性。 第1章前言101.3系统性红斑狼疮的易感基因1.3.1易感基因的筛选在上文列出的众多易感基因中，大量遗传学研究发现，SLE的易感性与肿瘤坏死因子诱导蛋白3（Tumor necrosisfactor alpha-induced protein3,TNFAIP3）的变异存在稳定的关联25。 TNFAIP3的表达由肿瘤坏死因子快速诱导。 它位于人类6号染色体的长臂，全长2370bp，2区3带的第三个亚带（如图1.3）；分子位置在染色体6上的碱基对137,866,317至137,883,314（Homo sapiensAnnotation Release109,GRCh38.p12）。 在结构上，它含有七个锌指结构域，其中一个具有蛋白连接酶（E3）活性。 N-末端含有去泛素化酶（DUB）结构域。 编码A20，后者是一种广泛表达的、可诱导的泛素酶，在树突细胞，B细胞，T细胞和巨噬细胞的发育和功能表现方面有突出作用3,26,27。 A20可以调节多种免疫细胞的功能，是非常有效的抗炎信号，近期很多领域的研究都强调了A20在临床和遗传病研究中的重要作用28。 TNFAIP3的异常表达与淋巴恶性肿瘤以及炎症和自身免疫疾病的发展有关。 TNFAIP3含有多个可遗传的突变位点，与SLE易感性具有关联，如图1.4所示20。 图1.3TNFAIP3在人类6号染色体上的位置，引自U.S.National Libraryof Medicine.第1章前言11图1.4TNFAIP3的突变与导致的人类疾病，引自Averil Ma.Nature Reviews (xx)1.3.2TNFAIP3影响的信号通路NF-B（Nuclear factorkappa-B）是一种核转录因子，是由细胞因子等各种细胞内和细胞外刺激激活的转录因子，可以选择性的结合在B细胞上调控许多基因的表达29。 它是一种蛋白质复合物，其控制转录的DNA，细胞因子产生和细胞存活。 NF-B几乎存在于所有动物细胞类型中，并参与细胞对刺激的反应，如应激，细胞因子，自由基，重金属，紫外线照射和细菌或病毒抗原30。 NF-B在调节细胞的炎症反应、对感染的免疫应答中起关键作用。 NF-B的不正确调节与癌症，炎症和自身免疫疾病，感染性休克，病毒感染和免疫发育不当有关。 因为NF-B控制着很多与炎症有关的基因，所以发现NF-B在许多炎症性疾病中具有慢性活性31。 TNFAIP3通过充当NF-B信号传导的负反馈调节剂来调节炎症免疫应答的能力。 并且对于细胞中NF-B信号通路的负调控至关重要32。 很多研究利用SNP的分析，得出结论TNFAIP3的表达异常和变异对NF-B的调节通路存在负调控，当NF-B的调控异常，NF-B表达增多，造成了炎症反应的发生，最终可以导致SLE。 因此TNFAIP3起到一个重要的制动器的作用，当它正常表达，可以抑制NF-B的表达，进而削减炎症反应；当TNFAIP3变异，无法正常表达，则失去了的NF-B的制动，炎症反应就会爆发，导致严重的自身免疫疾病3,20,27。 然而这种变异的具体位点，以及是否存在于中国汉族人群的SLE患者，这种变异在全球是否具有统一性，目前仍然没有相关研究。 中国汉族人群也存在同样的变异位点，这种变异与患病的影响是否与其他民族相同，中国汉族人群是否有自己独特的变异位点能够影响SLE的易感性，他们的变异与造第1章前言12成SLE的途径是否与现有研究相同，这些都没有得到确切证实。 1.4探究TNFAIP3的变异与SLE的关系通过GWAS人们可以得知位于TNFAIP3的SNPs与自身免疫病具有显著关联，其中11个位点的变异更是与SLE有关（如表1.4）20。 表1.4位于TNFAIP3上与SLE关联的SNPs TNFAIP3上影响SLE的SNPs1rs131928417rs22309262rs104991948rs50299533rs69202209rs77493234rs1049919710TTA5rs502993911rs69224666rs5029941图1.5位于TNFAIP3上的SNPs的位置，引自Lars Vereecke.Biochemical SocietyTransactions (xx)通过查阅文献，我们发现在欧洲和韩国人群中，已经展开过TNFAIP3与SLE患病的关联性和易感基因的研究。 在这两类人群中，最常见的复制关联是一类在TNFAIP3上的跨度约100kb的风险单倍体型12。 通过对基因中富集这种风险单倍体型的欧洲和韩国人群中的SLE患者进行有针对性的重新测序，发现了一对相邻的多态性二核苷酸变异，他们的SNP位点分别是rs148314165（变异位于Chr6第1章前言13(NC_000006.11):138,230,023-138,230,060）,rsxx20567（变异位于Chr6（NC_000006.11）138,230,022-138,230,059），他们合称为TTA33-35。 这种变异具有特殊性，那就是在这段基因连接的碱基，包含一个缺失与一个替换。 经证实，该类人群SLE患病与否与携带这种风险单倍体型的变异之间具有显著的关联。 在过往的研究中，人们已经对功能性TTA多态性二核苷酸在欧洲SLE患者的细胞系中调节TNFAIP3表达的机制进行了表征。 尽管现今越来越多的证据表明TTA的变异在欧洲与韩国人群中的SLE易感性相关，但是对于这些变异在汉族人群中存在与否，以及他们在SLE易感性中的作用的研究，仍然是一片空白。 因此我们主要关注的是中国北方汉族人群中TTA变异引起的TNFAIP3变异，与SLE易感性的研究。 在翻阅资料的过程中，我们还发现除了上述的TTA变异外，在外显子3的编码区还存在另一种的风险单倍体型的SNP rs2230926，能导致TNFAIP3蛋白中苯丙氨酸被半胱氨酸所取代（Phe127Cys127）。 尽管我们对编码变异影响NF-B信号传导的分子机制尚不清楚，但有体外试验表明，与非风险的T等位基因相比，编码变异的风险等位基因G与NF-B信号传导活性的降低有关36-38。 值得一提的是，有研究表明，在非洲裔美国SLE患者中，并没有发现其患病与携带编码变异的单倍体型存在显著的关联12。 同时，非洲裔美国人单倍型中不存在TTA变异37。 这些数据能表明该编码变异确实能影响A20的功能，但是这些变异不太可能成为影响SLE风险的最主要原因39。 位于TNFAIP3基因的两个SLE相关功能变异中，SNP rs2230926目前也尚未被证实在中国汉族人群中与SLE具有关联，而TTA变异目前尚未被研究40,41。 此外，我们对中国汉族患者上述两类变异之间的连锁不平衡（linkagedisequilibrium，LD）仍不清楚。 为了研究TNFAIP3的突变与中国汉族SLE的相关性，我们设计了如下的实验（如图2.1），我们建立了SLE患者与健康对照的样本库，其中包括SLE患者和健康对照。 为了探索TTA变异是否存在于中国汉族人群SLE患者，我们从样本库选择部分SLE患者和健康对照，以TTA位点为中心，提取全血DNA并使用PCR扩增TTA位点及其上下游共800bp长度，然后对他们的基因进行重新测序，用测序结果进行等位基因频率的计算，我们发现，SLE患者TTA变异的基因频率显著大于健康对照组，因此可以确定TTA变异存在于中国汉族SLE第1章前言14患者。 下面我们使用Genotyping技术，对患者组以TTA变异进行基因分型，并与健康组作对