【毕业学位论文】（Word原稿）日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建与东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因筛选生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 日本血吸虫 成虫 噬菌体展示 库的构建与东方田鼠 抗 血吸虫 抗性相关 基因筛选 to to I 摘 要 日本血吸虫病（ 我国一种危害严重的人畜共患寄生虫病。东方田鼠是迄今发现的唯一一种具有抗血吸虫病作用的哺乳动物。如能筛选、克隆出东方田鼠 抗 血吸虫抗性相关 的日本血吸虫 基因，可以为开发抗血吸虫疫苗和治疗药物提供新技术、新思路。 噬菌体展示技术（ 近年建立和发展起来的利用噬菌体融合表达外源基因的一项新技术，已广泛应用于分子间识别机制的研究。 本研究首次应用 菌体展示系统构建了日本血吸虫成虫噬菌体展示 库， 并 用东 方田鼠阴性血清筛选该文库，以期筛选到 与东方田鼠抗血吸虫抗性相关的 日本血吸虫基因。 方法与结果 1 日本血吸虫成虫噬菌体展示 库 的构建 ： 原 始文库的库容量为 106 增后文库滴度为 1011 随机挑取的 96 个噬菌斑进行 定，重组率为 其中 插入片段大于 300 7 种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。 2东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因的筛选 ： 分离东 方田鼠阴性血清，用亲和淘洗的方法筛选文库 。经三轮筛选，阳性克隆得到有 效富集，共获得 10种目的基因的 中 7种与 似性达到 99% 100%； 1 种与其他物种基因有82%相似性，另外 2 种没有发现显著相似的基因。功能预测结果表明，部分 码的蛋白或多肽分子功能主要是结合作用、酶活性及结构蛋白。 结论 本 研究 成功构建了 日本血吸虫成虫噬菌体展示 库 ，并利用 东方田鼠阴性 血清 成功 筛选到 10 种目的基因的 列 ， 为深入阐述东方田鼠抗血吸虫分子机理和寻找新候选疫苗抗原分子奠定了基础。 关键词 日本血吸虫 噬菌体展示 库 成虫 东方田鼠 亲和淘洗 is of in in is to in It of to to is a in we in to to . A T7 06 of 011 CR 6 at in 00bp in 2. to to by 10 7 of 9% 100%; 1 of 2% no of of or of A T7 0 to in to of 录 第一章 绪论 . 1 本血吸虫病 . 1 吸虫疫苗的研究 . 3 方田鼠抗日本血吸虫的研究 . 5 本血吸虫 库的构建 . 9 菌体展示技术在抗血吸虫疫苗研究中的应用 . 10 第二章 日本血吸虫成虫噬菌体展示 库的构建 .料与方法 . 15 果 . 22 论 . 26 第三章 东方田鼠抗日本血吸虫 抗性相关 基因筛选 .料与方法 . 28 果 . 33 论 . 37 第四章 全文结论 .考文献 .录 .谢 .者简历 . 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 l 升 m 米 苄青霉素 本的碱基配对搜索软件 bp 基对 血清白蛋白 补 d 碳酸二乙酯 氧核糖核酸 磷酸脱氧核苷酸 硫苏糖醇 EB 化乙锭 肠埃希菌 二胺四乙酸 联免疫吸附测定 达序列标签 根过氧（化）物酶 h L B 培养基 M 摩尔浓度 mg 克 V ml 升 使 摩尔 尔 美生物技术信息中心 OD 密度值 放阅读框架 酸盐缓冲溶液 合酶链反应 菌斑形成单位 糖核酸 热水生菌 合酶 冲液 ,3,5,5,3,5,5（羟甲基）胺基甲烷 维网 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 血吸虫病 （ 是由血吸虫 （ 感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。据世界卫生组织专家估计，目前全球仍有 74 个国家和地区流行血吸虫病，有 2 亿人受感染， 6 亿人受威胁（ 等， 2000）。人体 血吸虫病的主要病原为曼氏血吸虫（ 埃及血吸虫（ 间插血吸虫（ 日本血吸虫（ 湄公血吸虫（ 周述龙等， 2001）等 。在我国流行的血吸虫病病原为日本血吸虫（中国大陆株）。 本血吸虫病 日本血吸虫病在我国的流行情况 日本血吸虫病（ 流行于我国南方十二个省（市、自治区），至今仍在 108 个县和 57 个县级农场流行，这些地区大部分是我国农业生产的重要基地。目前，由于自然和人为因素的影响，对湖沼地区和大山区的血吸虫病仍缺乏有效的防治对策，受威胁的流行区人、畜各有近 1 亿，每年为防治该病花费巨大（郑江， 2002；陈贤义， 2001）。 近年来，由于生物、自然和社会、经济等因素变化较大，我国血吸虫病疫情出现反复，局部地区疫情回升。表现为血吸虫病患病人数增多，急性感染人数呈上升趋势，局部地区钉螺扩散明显，感染性钉螺分布范围扩大，部分已经达到传播控制标准和传播阻断标准的地区疫情回升，出现向城市蔓延的趋势，对人民健康、经济发展和社会进步构成威胁，血防工作形势严峻。据报道，2004 年我国有血吸虫病人 842 525 人；急性感染病人 816 例；血吸虫病流行区耕牛感染率为 全国共查螺 701 出 钉螺面积 306 中新发现有螺面积 阳等， 2005）。专家估计，如控制不力，部分地区将可能发生急性血吸虫病爆发流行。“瘟神”有可能卷土重来，对我国疫区人民的健康和经济的发展造成极大的灾难。“做好血吸虫病防治工作关系到人民的身体健康和生命安全，关系到经济发展和社会稳定”（胡锦涛同志 2004 年批示）。血吸虫病的研究 不仅 具有经济意义而且具有政治意义。 目前我国血吸虫病防治的主要难点是： 日本血吸虫的中间宿主 钉螺（ 以消灭 ； 人畜重复感染严重，单靠以化学药物治疗为主的防治策略不能有效控制血吸虫病的流行 ； 保藏宿主种类多，数量大，活动范围广，难以控制，大家畜（特别是牛）的 粪便 是最重要的传染源。当前我国血吸虫病的防治又面临新的问题，例如： 全球气候变暖可能使钉螺向北方地区扩散，扩大血吸虫病的流行范围 ； 三峡大坝的建设改变 了 库区的生态环境， 可能 形成适于钉螺生存的客观条件 ； 南水北调工程的东线和中线引水区造成钉螺扩散的可能性必须引起关注 ； “退耕还湖、平垸行洪、移民建镇”治水方针的实施将会使一些湖区钉螺的孳生面积扩大（汪天平等， 2005； N 等， 2002）。因此，血吸虫病防治需有新思路、新举措。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 日本血吸虫生活史 日本血吸虫的生活史比较复杂，包括在终宿主体内的有性世代和在中间宿主钉螺体内的无性世代的交替。生活史分成虫、卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫等 7 个阶段。成虫不同于其他吸虫，是雌雄异体，生活状态通 常是雌雄合抱。 日本血吸虫成虫寄生于人及多种哺乳动物的门脉肠系膜静脉系统。雌虫产卵于静脉末梢内，虫卵主要分布于肝及结肠肠壁组织，虫卵发育成熟后，肠粘膜内含毛蚴虫卵脱落入肠腔，随粪便排出体外。含虫卵的粪便污染水体，在适宜条件下，卵内毛蚴孵出。毛蚴在水中遇到适宜的中间宿主钉螺，侵入螺体并逐渐发育。先形成袋形的母胞蚴，其体内的胚细胞可产生许多子胞蚴，子胞蚴逸出，进入钉螺肝内，其体内胚细胞陆续增殖，分批形成许多尾蚴。尾蚴成熟后离开钉螺，常常分布在水的表层，人或动物与含有尾蚴的水接触后，尾蚴经皮肤而感染。尾蚴侵入皮 肤，脱去尾部，发育为童虫。童虫穿入小静脉或淋巴管，随血流或淋巴液带到右心、肺，穿过肺泡小血管到左心并运送到全身。大部分童虫再进入小静脉，顺血流入肝内门脉系统分支，童虫在此暂时停留，并继续发育。当性器官初步分化时，遇到异性童虫即开始合抱，并移行到门脉肠系膜静脉寄居，逐渐发育成熟交配产卵。 血吸虫致病机理 血吸虫发育的不同阶段，尾蚴、童虫、成虫和虫卵均可对宿主引起不同的损害和复杂的免疫病理反应。由于各期致病因子的不同，宿主受累的组织、器官和机体反应性也有所不同，引起的病变和临床表现亦具有相应的特点和阶段性。 尾蚴穿过皮肤可引起皮炎，局部出现丘疹和瘙痒，是一种速发型和迟发型变态反应。童虫在宿主体内移行时，所经过的器官（特别是肺）出现血管炎，毛细血管栓塞、破裂，产生局部细胞浸润和点状出血。成虫一般无明显致病作用，少数可引起轻微的机械性损害，如静脉内膜炎等。血吸虫病的病变主要由虫卵引起。虫卵主要是沉着在宿主的肝及结肠肠壁等组织，所引起的肉芽肿和纤维化是血吸虫病的主要病变。 肉芽肿形成和发展的病理过程与虫卵的发育有密切关系。虫卵尚未成熟时，其周围的宿主组中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 织无反应或轻微的反应。当虫卵内毛蚴成熟后，其分泌的酶、蛋白质及糖 等物质称可溶性虫卵抗原（ 可诱发肉芽肿反应。 过卵壳微孔缓慢释放，致敏 T 细胞，当再次遇到相同抗原后，刺激致敏的 T 细胞产生各种淋巴因子。研究结果表明：巨噬细胞吞噬 后将处理过的抗原呈递给辅助性 T 细胞（ 同时分泌白细胞介素 1（ 1），激活 产生各种淋巴因子，其中白细胞介素 2（ 进 T 细胞各亚群的增生； 上述释放的淋巴因子外，还有嗜酸性粒细胞刺激素（ 成纤维细胞刺激因子（ 巨噬细 胞移动抑制因子（ 吸引巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及成纤维细胞等汇集到虫卵周围，形成肉芽肿，又称虫卵结节。虫卵肉芽肿的形成是宿主对致病因子的一种免疫应答。一方面通过肉芽肿反应将虫卵破坏清除，并能隔离和清除虫卵释放的抗原，减少血液循环中抗原抗体复合物的形成和对机体的损害；另一方面，肉芽肿反应破坏了宿主正常组织，不断生成的虫卵肉芽肿形成相互连接的疤痕，导致干线型肝硬变及肠壁纤维化等一系列病变。 （石佑恩， 1995） 吸虫疫苗的研究 血吸虫疫苗研制的必要性和可行性 解放初期至上世纪 80 年代 初，我国血吸虫病防治主要采取以灭螺为主的综合措施。随着高效低毒治疗药物吡喹酮的问世，血防策略转变未以疾病控制为主，即通过大规模人、畜化疗，结合易感地带灭螺来控制疫病、降低感染。进两年来，通过对过去 50 年血防经验和教训的总结，提出了以控制传染源为主的综合防治策略，即通过改建卫生厕所、建沼气池、以机种代牛耕、禁止在有螺地带放牧家畜、推行家畜圈养、加强患病家畜查治等，切断血吸虫的传播环节。 （郭家钢， 2006） 多年实践证明连续群体化疗在血吸虫未消灭地区只能暂时降低发病，而不能阻断传播，同时，化疗还存在不能修复组织 损害，化疗后病人、病畜重复感染，某些血吸虫株对化疗药物产生抗性等严重缺点。国际普遍认为：化疗必须与一种具有更长期效果的辅助措施相结合。 对我国现阶段的社会、经济状况来说，要在血吸虫疫区完全推行家畜圈养、禁止在有螺地带放牧难度极大。 因此，发展血吸虫疫苗是综合防治血吸虫病的一项具有战略意义的辅助措施。 血吸虫发育生物学特点表明，血吸虫疫苗介入抗虫、抗卵和抗生殖等多个攻击靶环节均具有实际意义。血吸虫流行病学调查提示，人体 及家畜 对血吸虫再感染具有一定的保护性免疫力，这是研制血吸虫疫苗可能性的事实依据。现代血吸虫免疫学 的发展对血吸虫免疫机制有了更深入的了解，为疫苗研制提供 了 理论基础。现代免疫学和分子生物学技术为疫苗研制提供了高科技手段。 1991 年世界卫生组织在瑞士日内瓦召开的血吸虫病疫苗战略研讨会上一致认为血吸虫疫苗有研制的必要性、可行性。尽管血吸虫疫苗研制难度较大，在短期内很难成功，但前景广阔。为了推动血吸虫疫苗的研制，世界卫生组织热带病研究培训特别规划署（ 将血吸虫疫苗研制置 于血吸虫病防治研究的优先地位。在我国，日本血吸虫病基因工程疫苗项目已纳入了国家 863 计划 等高技术计划范畴，近年国家划拨总理预备基金专款，资助日本血吸虫（中国大陆株）疫苗的研究。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 血吸虫疫苗的研究现状 血吸虫疫苗的研究已有 60 多年的历史，它大致经历了死疫苗、减毒活疫苗、 苗和合成肽疫苗几个阶段（ ， 1991）。死疫苗诱导机体产生的抗感染保护力效果不佳；减毒活疫苗虽能诱导较好的保护力，但存在虫体来源有限、毒力回复等问题。随着分子生物学手段的改进，目前大多数研究人员开始从日本血 吸虫的各种抗原分子免疫原性上进行分析，以期研究出有效的基因工程疫苗，避免了虫体天然蛋白来源困难的问题（ A 等， 1999）。 苗是近年来发展较快的一种新型疫苗，与 苗一起称为核酸疫苗，是由编码引起保护性免疫反应的基因片断和克隆 表达载体构建而成，通过直接注射入宿主体内，让体内的细胞来表达抗原，从而致敏机体免疫系统，产生细胞免疫和体液免疫。目前已开展了一些血吸虫抗 原候选分子 苗的动物实验及免疫应答研究，并显示了良好的应用前景。合成肽疫苗分子是由多个 B 细胞抗原表位和 T 细胞抗原表位共 同组成的，大多需与一个载体骨架分子相耦联。合成肽疫苗作为近些年来研究的一种新型疫苗，尤其作为一种治疗性疫苗，有着良好的应用前景，但在诱导免疫动物产生较好保护作用方面还存在许多难以克服的困难，至今仍未获得一种具有理想保护作用的血吸虫合成肽疫苗。 迄今已鉴定的血吸虫抗原分子超过 100 种，动物实验保护性一般在 30 50。其中已克隆表达的重组疫苗分子有 20 种以上，来源于血吸虫尾蚴、童虫、成虫、卵等各阶段，按其性质划分，包括表面相关抗原、结构蛋白、酶和生理蛋白。 克隆、表达的疫苗候选分子 表膜相关抗原 222325 50 膜相关分子 结构蛋白 副肌球蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白，微管蛋白 酶 谷胱甘肽 S转移酶，苹果酸脱氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶，糖酵解酶（磷酸甘油醛异构酶 酸甘油脱氢酶，醛缩酶，烯醇化酶），蛋白酶（血红蛋白酶，胰蛋白酶） 生理蛋白 脂肪酸结合蛋白，钙结合蛋白，钙网蛋白，热激蛋白（ 0,90） 由于血吸虫在长期进化中产生了免疫逃避机制等原因，各个类型的血吸虫疫苗产生的抗感染保护率都不高，这是血吸虫疫苗研制的关键问题。 定的 6 个最有希 望的血吸虫候选疫苗分子（ 以及随后克隆表达的数十个候选疫苗分子，经过多年的动物实验研究，证实各类型疫苗诱导机体产生的抗感染保护力不太理想，疫苗诱导的动物保护力大约在 30% 40%之 间（ 等， 2002），所以继续筛选高保护 力的候选分子、研制新型疫苗成为当前工作的热点与难点。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 血吸虫疫苗前景展望 全世界普遍认为，血吸虫疫苗并非指日可待，但是其前景充满希望。验证、分析乃至制备生物特异性抗原技术已具备或基本具备。从 20 世纪 70 年代 杂交瘤技术建立，到 90 年代 组技术出现，使人们试图得到大量的血吸虫“靶抗原”重组蛋白成为可能，为血吸虫病疫苗研制工作带来了新的希望。 20 世纪 70 年代以来，随着免疫学研究进展，加强了对血吸虫病保护性免疫、发病机制以及虫卵肉芽肿形成机制的研究，丰富了血吸虫疫苗研究基础知识，尤其近十几年来现代生物化学及分子生物学在寄生虫学领域的广泛应用，使得疫苗候选分子的鉴定、基因克隆及表达等方面得到迅速发展。人类相关性的基础研究积累已为人类血吸虫疫苗的研制与开发铺平了道路。 曼氏血吸虫前期大量研究为临床应用奠定了坚实基 础，曼氏血吸虫疫苗研究焦点将转入临床I 期试验和规模化生产制备试验。与曼氏血吸虫比较，流行区人群对日本血吸虫病的免疫保护力要低弱，在持续时间上更短暂，制备高效的人用日本血吸虫疫苗无疑难度更大。此外，日本血吸虫疫苗研究起步较晚，无论从研究的深入程度、研究规模、研究经费投入都相对落后 于 曼氏血吸虫。尽管难度大，但并非没有希望。应该看到，我国日本血吸虫病属人畜共患病，牛、羊是重要的保虫宿主和传染源，因此，在研制人用疫苗难度更大的情况下，首先从兽用疫苗予以突破具有实际意义。 10 多年来的 研究积累缩短了我国日本血吸虫疫苗与国际曼氏血吸虫疫苗研究的差距，很多方面已接近或达到国际先进水平。国内专家认为：目前的疫苗研究不能中断，如能继续获得专项支持，集中优势力量组织 攻关 ，在若干年内制成一种能在抗传播上 起 积极作用的实用性兽用疫苗是可能的。 血吸虫是一种多细胞生物，基因组比细菌、病毒复杂得多，由于人类对个别抗原 的 应答在遗传学上的不均一，得到的单个克隆抗原不可能获得完全的抗感染保护力。因此，在选择疫苗介入的靶点时，应以抗感染为主，同时探讨抗合抱、抗生殖、抗卵胚或抗肉芽肿的抗原分子，走多价、多位点攻击的技 术路线，制备成多价的“鸡尾酒”疫苗。 研制出具有实用价值的血吸虫疫苗，需要进行长期而艰苦的攀登，要解决一系列疫苗研制中出现的问题。现代分子生物学技术等高技术的发展和血吸虫疫苗的基础研究已取得的可喜成绩，为血吸虫疫苗研究的临床试验和生产制备展示了乐观前景，相信经过长期的艰苦奋斗，具有高保护性的血吸虫疫苗特别是兽用疫苗一定会实现。 东方田鼠抗日本血吸虫的研究 东方田鼠（ 分类学上属啮齿目（ 仓鼠科 (田鼠亚科 (田鼠属 (分布在我国湖南、湖北、安徽、浙江、江苏、福建、四川、贵州、广东、黑龙江、内蒙古、吉林、山东、陕西、甘肃、宁夏、辽宁等省份，在中蒙、中俄、中朝等边境的湖泊沼泽地带也有其踪迹，是我国血吸虫病中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 6 流行区洞庭湖湖洲广泛分布的一种优势鼠种。东方田鼠是迄今发现的唯一一种具有抗血吸虫病作用的哺乳动物。东方田鼠抗血吸虫病现象和抗病机制的研究长期以来一直是我国寄生虫学家所关注的重点领域。研究东方田鼠抗血吸虫病机理，为血防提供新思路与新武器，一直是寄生虫学者的努力方向。 1999 年，全国血防会议将东 方田鼠抗血吸虫病机制研究列为我国血防基础研究的重点工作之一。 东方田鼠抗日本血吸虫病现象 日本血吸虫的易感动物包括人，牛、羊等家畜及小鼠、家鼠等野生动物，涉及 40 多种哺乳动物。 20 世纪 50 年代初，我国曾对南方 13 个省、市 39 种哺乳动物进行血吸虫病调查，发现东方田鼠是唯一一种感染日本血吸虫后不致病的哺乳类动物，解剖上万只东方田鼠，其体内没有找到血吸虫成虫或虫卵。稍后吴光和黎申恺等多次调查得到同样结果 , 因此认为东方田鼠不是血吸虫的保虫宿 主 （ 吴光 等， 1962； 黎申恺 等， 1965） 。 1991 年， 朱国正等用 1000 条血吸虫尾蚴人工感染野生东方田鼠和实验室饲养的第二代东方田鼠，发现野生鼠和饲养鼠都具有抗日本血吸虫病的能力。并且，日本血吸虫单次和重复感染洞庭湖种群东方田鼠，虫体在两组鼠体内移行的部位、时间和移行数量的高峰期呈一致性，消亡时间和部位也大致相同。血吸虫在非疫区宁夏青铜峡种群东方田鼠体内存活时间较洞庭湖种群稍长些，虫体也略大，但不能发展到成虫诱发病变（李浩等， 2001）。可见，东方田鼠对日本血吸虫的抗性与获得性免疫无关，这种抗性既不因种群的地域性差别而不同，也不因相同地域内种群的传代而减弱。 日本血吸虫在东方田鼠体内的发育及炎症反应 日本血吸虫尾蚴由皮肤进入东方田鼠体内，经体循环到肺再到肝，其移行路线和金黄地鼠、c 小鼠体内的血吸虫童虫移行路线相同。在感染后的第 1内，童虫个体细小，为透明状，在高倍显微镜下能观察到口吸盘的轮廓。在感染后第 2 天在肺中观察到童虫，到 12 天时仍有捡出，感染后第 4 天，在肝脏可见到童虫，直到 18 天时仍有捡出，但第 19 天后体内未发现血吸虫虫体。东方田鼠体内血吸虫童虫只能发育到肠管汇合阶段，而在小鼠体内血吸虫能发育到成虫阶段，并产卵。就血吸虫童虫个体 大小而言，在感染 15 天时，东方田鼠体内存活的虫体大小为 676 m 260 m ，同期，日本血吸虫适宜宿主金黄地鼠体内虫体大小为 1338 m 410 m，比从东方田鼠体内获得的虫体大得多。扫描电镜观察到东方田鼠体内感染 7 天的虫体在大小上与小鼠体内虫体无明显差异，但有畸形现象。 11 天的虫体明显小于同时期昆明系小鼠体内虫体，其体表皮嵴低平而紊乱，体中部可见细小的体棘，并发现一些虫体死亡。同期昆明小鼠体内虫体体表皮嵴较高且连接成条索状，体中部未见体棘（李浩等， 2000；王庆林等， 2002）。 血吸 虫尾蚴感染东方田鼠后，肺期童虫炎症反应并不强烈，虫体周围组织有少量嗜酸性粒细胞浸润。肝期童虫炎症反应较强烈，虫体周围有大量嗜酸性粒细胞及少量中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等聚集，发生细胞浸润，肝组织中出现嗜酸性坏死物，切片中能看到虫体残片遗迹。中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 7 尾蚴攻击感染 42 天后解剖时，东方田鼠肝脏鲜红无斑点，呈结构性恢复（李浩等， 2000；王庆林等， 2002）。 东方田鼠抗日本血吸虫病机制初探 东方田鼠血清被动转移对小鼠的保护性 何永康等（ 1998）进行一系列东方田鼠天然抗日本血吸虫感染免疫特性的研究 , 结果表明东方田鼠血清被动转移使小鼠粪卵 蚴孵化率和肝组织内虫卵数均有很大程度的减少；其血清和 /或淋巴细胞具有很强的杀童虫作用；东方田鼠血清补体 细胞因子 4 均显著高于普通小鼠 ,且感染后均显著增高；免疫球蛋白 平在感染血吸虫前及感染后均显著高于普通小鼠； 东方田鼠淋巴细胞受血吸虫抗原刺激后其增殖效应与普通小鼠相比亦显著升高。蒋守富等（ 2004）的研究结果也证明东方田鼠血清被动转移给小鼠，使小鼠获得 36的减虫率和 减卵率，并且受体小鼠血清 其亚类抗体均有升高，其中抗童虫抗原的 体水平增幅最大。 体外试验 东方田鼠的新鲜血清与体外制备的血吸虫童虫在 37、 5 条件下共培养 16得显著的童虫死亡率（刘金明等， 2001；张新跃等， 2001；汪世平等， 1994）。在体外 验中，张新跃等（ 2001）发现东方田鼠脾细胞对血吸虫童虫的杀伤效果明显，校正死亡率达 野生鼠）和 繁殖鼠），并且与血清对童虫的杀伤作用具有协同效应。刘金明等（刘 金明等， 2001）体外杀伤试验也发现东方田鼠巨噬细胞和嗜酸性粒细胞可大量粘附于童虫体表，但似乎与童虫死亡率的关系不大，而东方田鼠天然血清对童虫的杀伤率可达 东方田鼠血清中抗血吸虫天然抗体 申群喜等（ 2002）比较了东方田鼠血清及东方田鼠心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、肌肉等组织 /器官的匀浆上清液对日本血吸虫童虫的杀伤作用，发现东方田鼠各组织 /器官与昆明小鼠各组织 /器官匀浆的杀伤童虫效应比较差异均无显著性，但东方田鼠血清杀伤童虫的效益很强。进一步分离东方田鼠血清组分，发现血清蛋白是 体外杀伤童虫的主要成分（欧阳理， 2003）。何永康等（ 1999）研究认为东方田鼠血清内存在天然抗日本血吸虫抗体，以抗童虫可溶性抗原 (抗体水平最高，抗成虫可溶性抗原 (抗体水平次之，抗虫卵可溶性抗原的抗体水平最低。蒋守富等（ 2001）进行了东方田鼠抗血吸虫抗体亚型研究，首次发现东方田鼠抗童虫 平明显高于 c 和昆明系小鼠，分别为后者的 和 ，表明东方田鼠 体在抗血吸虫病中可能发挥重要作用。傅志强等（ 2001）用间接 法检测，也发现东方田鼠天然 血清抗蚴抗原）的 体水平是抗 血清白蛋白）的 31 倍和 ，而 和 ，东方田鼠天然血清中抗 蚴抗原的 类抗体相对水平明显高于 c 小鼠。 验还证实了血吸虫候选疫苗抗原 胱甘肽 酸丙糖异构酶）、 23原大亲水区）、 肪酸结合蛋白）、 肌球蛋白）等都不是东方田鼠抗血吸虫病的主要靶抗原。 抗体亚类 作用机制尚不清楚，另有资料显示抗鼠贾第鞭毛虫 克隆抗体在体外可以粘附贾第鞭毛虫滋养体，并在补体存在的情况下杀灭滋养体（ F 等， 1992）。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 8 补体 般认为，补体系统在非特异性免疫和特异性免疫反应中发挥效应，其作用是多方面的（龙振洲， 1998）。 血清中含量最高的补体成分，其作用也最为关键，是连接补体经典和旁路激活途径的枢纽， 经典途径的活化阶段起着重要作用。 （ 1988）发现补体在大鼠对曼氏血吸虫的天然免疫中起重要 作用。东方田鼠天然血清中补体 K 等， 1999）的平均含量显著高于昆明系小鼠天然血清，分别达 和 。感染血吸虫 11 天后东方田鼠血清中补体 均水平呈上升趋势，至第 26 天时极显著地增加，分别上升了 东方田鼠感染血清对童虫的杀伤力远大于天然血清，但两种血清灭活补体后对虫体的杀伤力基本相似，显见灭活补体的东方田鼠血清对童虫的杀伤力减弱（刘金明等， 2002）。但申群喜等（ 2002）发现新鲜血清与灭活补体血清对童虫的杀伤力无显著差别（ P认为 补体参与杀伤童虫的可能性不大。 白细胞介素 由活化的 胞分泌的一种细胞因子，具有多种生物学效应。它可诱导 B 细胞分化为 泌细胞，诱导杀伤 T 细胞及 胞的活性（ B， 1987），诱导单核 抗原（ J， 1996），调节造血细胞的增殖及分化（ M 等， 1988）等。 东方田鼠天然血清中的含量显著高于昆明鼠天然血清，是后者的 。日本血吸虫尾蚴攻击感染后 9 天，东方田鼠血清 中 量达最高，上升了 K 等， 1999），这与东方田鼠体内童虫发育停滞开始的时间（约 11 天）接近。 日本血吸虫肠道蛋白酶对东方田鼠血红蛋白的消化作用 血吸虫通过自身的一系列蛋白酶将宿主红细胞中的血红蛋白降解为肽及氨基酸加以吸收利用，这是血吸虫的主要营养来源。王庆林等（ 2000）分析了日本血吸虫肠道蛋白酶对东方田鼠的血红蛋白作用，发现该蛋白酶能有效降解东方田鼠血红蛋白，且与其对昆明系小鼠血红蛋白的降解无明显差别。故推测日本血吸虫在东方田鼠体内发育受阻可能并非由于血 吸虫不能消化东方田鼠血红蛋白而引起营养缺乏所致。 东方田鼠感染日本血吸虫前后基因的差异性表达 东方田鼠感染日本血吸虫 7 d 时肺丝氨酸蛋白酶抑制剂基因没有表达变化 ,非特异性免疫相关基因 ,如溶菌酶 (各类组织蛋白酶 (因表达上调 ,而且肺内特异性免疫相关基因如 表达上调。这一现象得到东方田鼠感染日本血吸虫 12 d 时肺和肝中特异性免疫和非特异性免疫相关基因的上调表