【毕业学位论文】（Word原稿）长江中游棉区转Cry1A基因棉花杀虫蛋白表达及对靶标和非靶标害虫的影响农业昆虫与害虫防治硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 长江中游棉区转 of on F of on 录 中文摘要 英文摘要 前言 第一章 文献综述 1 第二章 长江中游棉区 花毒蛋白表达的季节性规律 7 材料与方法 7 结果与分析 8 小结与讨论 8 第三章 长江中游棉区 花对棉铃虫的抗性效率 11 材料与方法 11 结果与分析 12 田棉铃虫卵和幼虫数量动态及田间抗性结果 12 花各组织对棉铃虫的杀虫活性测定 15 棉铃虫在 花各组织器官上的分布 18 小结与讨论 18 第四章 长江中游棉区 花对红铃虫的抗性效率 21 材料与方法 21 结果与分析 21 2001 年 田红铃虫种群动态 21 2002 年 田红铃虫种群动态 21 小结与讨论 23 第五章 花对斜纹夜蛾存活率及种群动态的影响 25 材料与方法 25 结果与分析 25 花对斜纹夜蛾存活率的影响 25 虫剂对斜纹夜蛾的毒力测定 26 田斜纹夜蛾的种群动态 26 小结与讨论 28 第六章 花对棉蚜的生长发育及种群动态的影响 31 材料与方法 31 结果与分析 32 花对棉蚜生长发育的影响 32 花对 棉蚜繁殖力的影响 32 田棉蚜的发生规律 33 田棉蚜的为害情况 34 小结与讨论 34 第七章 讨论与结论 37 参考文献 39 申请学位期间已发表和即将发表的文章 45 致谢 46 作者简历 47 摘 要 自 20世纪 90年代后期以来，转 因棉成为了世界范围内用来控制棉花害虫的重要工具。我国的华北棉区及长江流域棉区也先后对 了摸清 在长江中游棉区的抗虫表现，更好地发挥 在长江中游棉区棉花害虫综合治理中的作用，本文以中国农科院生物技术中心提供的转 因棉 因）和美国孟山都公司提供的转 因棉 材料，研究了它们在长江中游棉区毒蛋白的季节性表达规律，对棉铃虫(红铃虫 (斜纹夜蛾 (抗性，以及对主要的非靶标害虫棉蚜 (生长发育及种群动态的影响。 结果表明，在长江中游棉区， 毒蛋白的表达量随 组织、生育期及品种的不同而呈显著变化 (P 棉铃虫幼虫在 对 P 但是幼虫密度则显著低于常规棉田。与常规棉相比， 各代红铃虫的控制效果为 控制效果为 控制效果。 通过室内饲喂 的不同组织和使用 食不同品种棉叶、花瓣和花心的斜纹夜蛾的死亡率无显著差异，但取食 蕾的斜纹夜蛾的死亡率显著高于其它相应的处理。 虫剂对斜纹夜蛾的 达 1170田调查表明，两 t 棉田的无显著差异。 室内生测和大田试验表明，与常规棉泗棉 3号相比， 活历期及繁殖力均无显著影响， 与常规棉田棉蚜的发生动态及为害情况也一致。 对 在长江中游 棉区对各种主要靶标及非靶标害虫影响的系统评价表明，在长江中游棉区种植 ，将有助于控制该地区的棉铃虫和红铃虫的危害，减少棉田农药的使用次数，控制棉蚜的暴发，使棉田生态系统朝良性的方向发展。但同时我们也发现，由于 对棉田斜纹夜蛾几乎无毒杀作用，这有可能导致斜纹夜蛾成为 田的主要害虫，从而威胁 此，有必要对该地区 田斜纹夜蛾的发生规律及种群动态进行跟踪调查，并对其灾变规律开展研究，以期能有效地控制其在 关键词： 转 因棉， 蛋白，棉铃虫，红铃虫，斜纹 夜蛾，棉蚜，抗性 t a to of 990s. t In to t to of to in of of t a o. on t of P 嫩尖、幼铃、嫩叶、蕾、苞叶 花瓣 花芯。通过对棉铃虫幼虫食物利用的实验表明，棉铃虫幼虫在 上的相对取食率、相对生长速率、近似消化率及粗生长效率均较对照显著降低，但取食 的棉铃虫幼虫的相对代谢速率则显著提高。 赵奎军等 20则在室内系统测定了 果显示， 理 6天后幼虫校正死亡率为 均显著高于取食常规棉的处理。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 天后， 1、 2龄幼虫的杀虫活性较强，对 3龄幼虫有显著的杀虫活性，对 2合比较 作用顺序为：叶 蕾 铃 花。取食 、铃的棉铃虫 2示出了很强的抑制作用。 龄幼虫有较强的抑制生长作用。不同器官抑制生长作用顺序 与杀虫活性相同，即：叶 蕾 铃 花，但相同器官对棉铃虫特定龄期幼虫的体重抑制率一般高于相应的校正死亡率。 15龄幼虫能部分化蛹及羽化，但其化蛹率显著低于取食常规棉的处理。 2天后，在存活的幼虫中只有 5龄幼虫能发育至蛹期并羽化为成虫。 2、 1993年， 报道了 果发现，在 %，一些 0天内未发现有烟芽夜蛾幼虫为害，而 对照品种的蕾、铃被害率已达 64%和 74%。但 其发生高峰期，还需使用化学农药加以控制 21。 2对 1996种植于亚历桑那州的 田红铃虫的危害情况调查发现，1996 年 田棉铃的平均危害率为 非 田的为 1997 年， 铃的平均被害率为 非 田的则为 表明在整个生长季节内， 花对红铃虫均有极高的控制效果。 的研究 23也得出了同样的 结果。 2000 年，吴孔明 7等研究了国产的 列的田间抗性。结果表明， 在大田条件下也对棉铃虫种群表现出了很好的控制效果，在棉铃虫发生高峰期， 田棉铃虫幼虫的百株虫量显著低于对照品种。 3、 对靶标害虫的行为影响 除了对靶标害虫具有毒杀和抑制作用外，还对它们的取食行为有较大的影响。 1993 年，研究表明，烟芽夜蛾在 上的取食时间减少 18%，静止时间增加为 60%，而对照组的烟芽夜蛾的取食时间及静止时间分别为 50%和 33%。部分 品系上的幼虫吐丝下垂 时间也明显增加。董双林 19的研究也表明，棉铃虫 3 龄幼虫在 上的取食时间比例降低了 爬行、静止及吐丝下垂时间的比例分别增加了 此外，研究还发现，昆虫可通过取食行为的改变来适应有毒食物。由于 各部位毒蛋白表达量的不同，其可能改变棉铃虫及其它靶标害虫在 上的取食行为。如烟芽夜蛾可通过选择性取食 蛋白含量较低的食物来避免 毒害作用 16,24。而 1等发现， 的白花组织最易遭受棉铃虫的危害。对 各器官内 蛋白的 含量分析表明， 花内组织毒蛋白的含量明显低于其它器官，并认为可能是 田棉铃虫幼虫成活的主要原因。但是，吴孔明等研究后认为 7，棉铃虫幼虫在 各组织上的分布与常规棉田并无显著差异，棉株后期 蛋白表达量的下降，和棉铃虫种群内个体间对 蛋白耐性的差别才可能是产生幼虫成活个体的原因。中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 尽管 部分改变了一些靶标害虫的取食行为，但研究发现， 没有影响靶标害虫成虫的产卵选择性 7,8。 三、 对其它鳞翅目害虫生长发育的影响 1998 年， 5研究了田间条件下 叶和铃对草地贪夜蛾（ 长发育的影响。结果表明，暴露于 、 4、 6、 8、 10、 12 天的草地贪夜蛾幼虫的存活率与对照无显著差异，显示出 对草地贪夜蛾基本无控制作用。然而，取食对照棉叶 6天和 12 天的草地贪夜蛾虫重则显著高于取食 3B 棉叶的虫重，幼虫历期和蛹历期也显著较短。取食不同品种棉花组织的草地贪夜蛾成虫的性比无显著差异。但研究也发现，取食 6用采集于田间的 叶饲喂甜菜夜蛾 1、 3、 5 幼虫 1、 2、 3、 4、 7 天后转入人工饲料，或全部用 蛹期时调查死亡率、幼虫历期、蛹历期、蛹重和生活史历期。结果表明，取食 叶的不同虫龄的甜菜夜蛾的死亡率均极低。但 1、 3 龄幼虫的历期延长，所有虫龄的幼虫均随取食 夏敬源 等 27对转单基因及双基因抗虫棉对甜菜夜蛾的抗性进行了测定。结果表明，尽管双价抗虫棉较单价抗虫棉对甜菜夜蛾的抗性要高，但两抗虫棉对甜菜夜蛾的抗性均不理想。 四、 对非靶标害虫生长发育及种群动态的影响 前所未有的成功的同时，其可能对棉田生态产生的风险效应也受到了国内外的广泛关注。由于 能会引起受体品种某些理化性状的改变。如武予清等 28通过测定 9393 棉花中缩合单宁的含量与棉花对棉叶螨、棉蚜等刺吸性害虫的抗性关系密切 29,30，高含量的缩合单宁有助于棉花抵御这些害虫。因此， 能会影响到 而导致 而引发其它生态灾难。 然而， 31用 然 后检查其是否受到影响。实验显示，取食 . . 外， 2通过监测 并没有为棉田新增任何种类的害虫。但也有人认为，普通棉田的 盲蝽蟓 (可能上升为 33。 在国内，目前有关 对棉田生态系统中非靶标害虫的报道也有许多。崔金杰等通过研究田非靶标害虫的种群动态后认为， 能导致棉蚜（ 棉田刺吸式口器害虫数量的上升 37,38，但王武刚 ,吴孔明等则持相反观点，认为由于 田防治棉铃虫化学农药用量的减少，导致瓢虫类、草蛉类和蜘蛛类捕食性天敌的数量大幅度增加，这些天敌的增加能有效地控 制 田棉蚜的发生与为害 39,40。中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 五、 对天敌昆虫的影响 它可通过影响棉田植食性昆虫的种群数量及生长发育状况而间接影响天敌。 关于 对害虫天敌影响的报道目前很不一致 ， 大多数室内实验证明 当瓢虫 蝽 0普通草蛉接以转 有 种捕食者的成虫发育、存活率及成虫数量均无不 利影响 41。 但也有人报道，普通草蛉的幼虫以表达 蛉的死亡率比对照组增加了 25 37，并且取食欧洲玉米螟的幼虫发育时间比对照组明显延长 42。 然而，在棉铃虫发生期间对 为 吴孔明报道 40， 1997河南省新乡市和河北省廊坊市种植的 系统调查表明，抗虫棉田瓢虫类、草蚜类和蜘蛛类捕食性天敌的数量与常规化学防治田相比有大幅度增加。 关于 金杰等 37,38， 43曾报道， 种群数量显著减少。但 4通过调查产卵于用 虫体内寄生蜂 出蜂情况，结果发现菜蛾幼虫中的 六、小结 总之，研究表 明， 芽夜蛾、红铃虫等靶标害虫表现出了很好的抗性，其基本上能控制住这几种害虫的田间种群数量。但是，对于甜菜夜蛾 地贪夜蛾有些鳞翅目的非靶标害虫， 的控制效果则较弱，还需要在现有的 在它们的发生高峰施以化学农药及其它防治手段才能控制住它们的危害。 对非靶标的其它昆虫种类， 作用机制目前也还不清楚。因此，还有必要对 田的昆虫种类及多样性进行监测，掌握各 种昆虫的演替规律，以尽可能减轻 可能造成的生态风险。中国农业科学院硕士学位论文 第二章 长江中游棉区 花毒蛋白表达的季节性规律 7 第二章 长江中游棉区 花毒蛋白表达的季节性规律 2 1 材料与方法 2 1 1 供试棉花品种及试验设计 中国农业科学院生物技术研究所提供，内含 因； 美国孟山都公司提供，内含 照非 规品种为 3517（市售）和泗棉 3号（江苏原种场提供，为 本试验在湖北省天门市进行， 2001 年及 2002 年的处理设置为：（ 1） 2） 4月中旬 播种。每处理重复 3次。小区面积 用随机区组排列。所有小区均实行常规管理，各处理在棉花的整个生长期内不施用任何农药。 2 1 2 样品的采集 2001年从 7 月中旬至 9月，每 2 周左右一次采集棉花各不同组织，将其封装于 5 8液氮浇灌后放于冰箱中冷冻备用。采样的标准为：顶尖刚舒展开的嫩叶，直径不大于 5刚开放的白花，及直径不大于 1 2002 年，从 5 月下旬至 9 月上旬，每 2 周左右对不同处理棉花组织进行标样采集，采样标准及保存方法同 2001年。 2 1 3 毒蛋白的测定 采用 法， 2001年 剂盒（包括毒蛋白提取剂、一抗、二抗）由“ 863计划”资助单位 北京大学生命科学院提供， 2002 年则由美国的 司提供。测定的具体操作步骤如下：（ 1）精确称取一定量（ 右）的棉花组织样品，加入 冲液后充分研磨。(2)8000r/上清液 别加浓度为 50mg/ 冲液，充分振荡， 4 冰箱放置 3） 8000r/心 5上清液 50 l 加入酶标板的孔内（重复 2次），加 00 l。在同一酶标板上其它三行孔中加不同梯度的 成后置 4 冰箱过夜。另立即将一抗血清按 1： 9比例与封闭液（ 液）混匀置 4 冰箱 上备用。（ 4）将酶标板孔内液体甩去，并在滤纸上轻磕除去残液，每孔加 300 次。（ 5）用 孔加一抗稀释液 150 l， 37 保温 6）重复步骤（ 4），每孔加二抗溶液 150 l， 37 7）重复步骤（ 4）后 ，蒸馏水洗板 2 次。（ 8）每孔加 100 物显色，反应 18孔加 50 l 2 的硫酸溶液终止反应，在酶标仪 450测定吸光值。整理测定数据结果，作出标准曲线，确定各个棉花组织样品中杀虫蛋白的含量。中国农业科学院硕士学位论文 第二章 长江中游棉区 花毒蛋白表达的季节性规律 8 2 2 结果与分析 2001 年 ， t 毒蛋白含量最高的组织分别为 7月 16日的蕾、 8月 5日和 8月 17 日的花柱、 8月 30日的蕾。其含量分别为 ng/g、 ng/g、 ng/g ng/g。 不同标样日期内 蛋白含量最高的组织分别为 7 月 16 日的花瓣、 8 月5 日的花柱、 8月 17日的花瓣和 8月 30 日的蕾，以上各组织内 ng/g、ng/g、 ng/g、 ng/g。 2002 年，在棉花现蕾以后， 组织在标样日期内毒蛋白含量最高的分别为 6 月31 日的顶叶、 7 月 17 的蕾、 7 月 29 日的花柱、 8 月 15 日的花瓣和 9 月 1 日的蕾，毒蛋白的含量分别为 ng/g、 ng/g、 ng/g、 ng/g、 ng/g。 标样日期内毒蛋白含量最高的组织分别为 6 月 31 日的顶叶、 7 月 17 日的花瓣、 7 月 29 日的花柱、 8 月15 日的花瓣和 9 月 1 日的花柱，含量分别为 ng/g、 ng/g、 ng/g、 ng/ng/g。将两年的数据进行综合分析表明，从空间上看， 叶、蕾、花瓣、花柱内毒蛋白的含量要高于子房和铃；从时间上看， 各组织内毒蛋白的含量表现为前期较高，中期有所下降，而到了后期，则略有回升。对不同的品种而言，在整个生长季 节内， 组织内毒蛋白的含量变化幅度要较 大，且平均含量要低。 方差分析表明，在长江中游棉区， 组织内毒蛋白的表达随 花的品种、组织及生育期有显著的差异 (P 图 1 田和常规棉田棉铃虫卵季节性消长规律（ 2001，天门） 图上所显示的点均为平均值 1 标准误。方差分析显示（ 验），不同处理的高峰期卵量无显著差异（ P of t 2001, 1 of in no in P - J u n 2 1 - J u n 1 - J u l 1 1 - J u l 2 1 - J u l 3 1 - J u l 1 0 - A u g 2 0 - A u g 3 0 - A u g 9 - S e p 1 9 - S e p 2 9 - S e ）G K 1 9B G 1 5 6 03517中国农业科学院硕士学位论文 第三章 长江中游棉区 花对棉铃虫的抗性效率 13 对棉铃虫幼虫发生量的调查显示，在 7 月 19 日、 7 月 24 日、 8 月 4 日、 8 月 9 日和 8 月 24日， 田棉铃虫幼虫的发生量显著低于常规棉 3517 田 (F = 2, 6; P = F = 2, 6; P = F = 2, 6; P = F = 2, 6; P = F = 2, 6; P = 在棉花的整个生长季节内，常规棉 3517 田棉铃虫幼虫的最高发生量可达 28 头 /百株， 而两 的百株虫量则始终低于 7 头。 2002年，各处理棉田的卵密度与 2001年基本相似（见图 3）。方差分析表明，在整个生长季节内， 田与非 田的落卵量无显著差异（ P然而，在 7 月 20 日、 8 月 15 日、 8月 20日、 8月 25 日、 8月 30日、 9月 5日、 9月 10日及 9月 15日， 号 (F = 2, 6; P = F = 2, 6; P of of t 002. 1 of in no in 图 4 与非 田棉铃虫幼虫种群动态（ 2002，天门） 图上每点显示为平均值 1 标准误。不同字母表明幼虫密度达 著水平（ 铃 蕾；而取食 、花、铃的棉铃虫的第 5天校正死亡率为 不同组织的杀虫活性也表现为：花 叶 铃 蕾。 8 月 2 日， 上四种组织对棉铃虫的校正死亡率为 不同组织的杀虫活性顺序仍为：花 叶 铃 蕾；此时， 种组织的校正死亡率分别变为 各组织的抗性顺序变为：蕾 花 铃 叶； 9月 8日， 抗虫性顺序为：蕾 花 铃 叶； 校正死亡率为 抗虫性顺序为： 蕾 花 铃 叶。方差分析表明，不同的 对棉铃虫的校正死亡率不同但无显著性差异（ F=但 不同组织对棉铃虫的校正死亡的差异达显著水平（ F=; in a by 验）。 1. of t no in on P 0:05). 图 2 2002年 红铃虫卵密度。 图上每点显示为平均值 1 标准误。 验显示，不同品种棉田红铃虫落卵量无显著差异（ P 2. of t 001. no in on P 0:05) - M a y 1 4 - J u n 2 9 - J u n 1 4 - J u l 2 9 - J u l 1 3 - A u g 2 8 - A u g 1 2 - S e p 2 7 - S e ）B G 1 5 6 0 ( B t )G K 1 9 ( B t )H B 3 5 1 7H B 3 5 1 7 ( c h e m i c a l )01002003004005006007003 0 - M a y 1 3 - J u n 2 7 - J u n 1 1 - J u l 2 5 - J u l 8 - A u g 2 2 - A u g 5 - S e p 1 9 - S e ）B G 1 5 6 0 ( B t )G K 1 9 ( B t )S I M I A N 3S I M I A N 3 ( c h e m i c a l )中国农业科学院研究生院硕士学位论文 第四章 长江中游棉区 花对红铃虫的抗性效率 23 4 3 小结与讨论 研究表明，在 2001 至 2002年间，长江中游棉区 常规不施药棉田相比， 不同代别的红铃虫幼虫的控制效果达 100%； 100%；而在常规化防棉田，在 2001 年施药 9 次和 2002 年施药达 11 次的情况下，其对红铃虫的控制效果也仅为 在该地区，尽管 对红铃虫的控制效果低于其在美国亚历桑那州的表现 22，但我们认为，在这一地区种植 仍将能很好地控制红铃虫的为害，同时也有利于这一地区棉田的害虫的治理。 对 各组织内毒蛋白的表达规律研究表明，随棉株的生长发育，其组织内 蛋白的表达量逐渐降低，其抗虫性也随之下降 15。我们通过研究 对红铃虫的控制效果也证实，在 9、10月份，有一部分取食 而， 且在美 国亚历桑那州的研究表明，长时期的种植 压制了该地区红铃虫的发生，同时也减少了农药的使用 51。尽管许多事例表明，那些后期发生的害虫对作物造成的危害相对较小，但在 生长发育后期存活下来的红铃虫幼虫将有助于促进红铃虫对 抗性的发展 52，单一的种植 也会对红铃虫造成持续的高压选择。模拟模型和一些试验数据显示，如果没有避难所内的敏感品系，随种植面积的扩大，害虫对 52。因此，当长江中游棉区对 何延缓红铃虫对 目前，美国南部 一些地区已经建立起了红铃虫对 中包括避难所的设计 53。另外，美国的亚历桑那州自 1996年起就开始了红铃虫对 的抗性监测。然而，由于 使得在美国使用的一些措施可能并不适于我国的长江中游棉区，因此，我们有必要进一步开展 在我国长江中游棉区的部署及抗性治理策略的研究。 表 2 2001间湖北天门地区不同品种 田红铃虫的为害虫情况 . of on 001 002 年份 7 月 月 月 0 月 种 花数 花虫量 总铃数 铃羽化孔 铃数 铃羽化孔 铃数 铃虫量 001 294 834 173 00 318 947 964 00 517 2376 265 738 00 517 (2578 874 756 00 002 774 257 708 00 152 211 937 00 棉 3 号 654 015 593 00 1932 409 894 00 ：在相同年份的每一列内，数字后字母不同的表示差异显著。 s), a in P 但取食 号蕾的斜纹夜蛾的存活率 ( 3d 叶 0, 6 , 6 瓣 , 6 心 , 6 , 8 3, 8 3, 8 Pf 7d 叶 0 0, 6 , 6 瓣 , 6