【毕业学位论文】（Word原稿）盐胁迫下紫花苜蓿根系蛋白质组的初步分析草业生物技术硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 盐胁迫下紫花苜蓿 根系 蛋白质组 的初步分析 of .) of .) I 摘 要 土地盐碱化是影响农业生产和生态环境的严重问题。利用生物技术提高牧草和农作物耐盐碱性，可以实现对盐碱地的有效利用和改良，而克隆耐盐碱相关基因 、 研究耐盐碱调控机制，是通过基因工程 手段 提高植物耐盐 碱 性的基础。 本文以高耐盐苜蓿品种“中苜一号”为试验材料，应用双向 凝胶电泳技术对其根系蛋白质组的表达谱进行差异分析。本试验对双向电泳的 一 些重要技术环节进行探讨，对其过程中蛋白质样品 的 制备、等电聚焦、平衡、凝胶染色等几个重要环节进行了优化。通过比较研究 ， 得出酚抽提法适合紫花苜蓿根系总蛋白质的提取；改良的胶体考马斯亮兰方法是较灵敏且重复性高的蛋白质染色方法；建立了适合紫花苜蓿的 2用优化的双向电泳方法，对盐胁迫下苜蓿根系蛋白质组进行差异分析， 共得到 533个蛋白点，其中 59 个蛋白点表达量发生改变，改变量超过2 倍，其中 17 个蛋白点表达量上调， 42 个蛋白点表达量下将 ，并对其分子量、 进行了初步理论鉴定 。本试验将蛋白质组学的新方法应用于苜蓿抗逆机制的研究，也展示了 可 将其应用于牧草的其它研究的可能性。 关键词 ： 紫花苜蓿根系，盐胁迫，双向凝胶电泳，质谱 he of of of to of of is to of of of by as to on of by of as of we of is of we a to So we a is in of of of 33 59 17 42 D .0 to of pH of in of in 录 2007 . 错误 !未定义书签。 英文缩略表 . 0 第一章 文献 综述 . 1 白质组学研究进展 . 1 蛋白质组学的概念 . 1 蛋 白质组学内容 . 1 蛋白质组学的研究方法 . 2 向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2. 2 谱 (技术 . 3 白质芯片 (技术 . 4 酵母双杂交系统 (. 5 物信息学技术 . 5 物蛋白质组学研究进展 . 6 植物器官或组织的蛋白质组学研究 . 6 物亚细胞的蛋白质组学研究 . 7 绿体的蛋白质组研究 . 7 粒体蛋白质组学分析 . 8 物膜蛋白质组学研究 . 8 植物细胞核和核仁蛋白质组研究 . 9 白质组学应用于植物逆境胁迫研究的进展 . 9 高温胁迫 . 9 低温胁迫 . 10 水分胁迫 . 10 盐胁迫 . 11 氧化胁迫 . 11 机械伤害 . 11 第二章 材料与方法 . 13 料 . 13 验材料 . 13 实验试剂 . 13 实验仪器 . 13 实验主要试剂配制 . 13 法 . 14 白质提取 . 14 酮沉淀法 . 14 酚 /醋酸铵抽提法 . 14 白质浓度测定 . 15 一向固相 度等电聚焦 . 15 条的平衡 . 16 二向 泳 . 17 胶染色 . 17 染 . 17 良的胶体考染法 . 18 泳凝胶图像分析 . 18 白质凝胶斑点切取 . 19 白质质谱分析 . 19 白质胶内酶解 . 19 白质样品脱盐 . 19 质量指纹图谱法鉴定蛋白质 （ S） . 20 S 数据分析 . 20 第三章 结果与分析 . 21 花苜蓿根系蛋白质的提取及双向电泳条件的优化 . 21 同蛋白质提取方法的比较、选择 . 21 白提取液和裂解液的选用 . 23 白上样量的确定 . 24 向等电聚焦条件的优化 . 25 衡条件的优化 . 25 向 泳条件的优化 . 26 色方法的比较 . 27 胶图像分析 . 28 花苜蓿双向电泳图谱分析 . 29 胁迫下紫花苜蓿根系蛋白质组的差异表达分析 . 30 第四章 全文结论 . 35 参考文献 . 36 附录 . 41 致 谢 . 43 作 者 简 历 . 44 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 0 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 2双向 凝胶电泳 pH 固相化 度 电点聚焦 道尔顿 硫苏糖醇 二胺四乙酸二钠 -(-(3 胺 丙 基 )血清白蛋白 睛 烯酞胺 ,N,N丙烯酞胺 4肉桂酸 质 辅 助 激 光 解 吸 附飞行时间质谱 谱 肽质指纹图谱 聚丙烯酰胺凝胶电泳 联聚乙烯吡咯烷酮 二烷基磺酸钠 四甲基乙二胺 三 羟 甲基氨基甲烷 电点 三氯乙酸 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文 献 综述 1 第一章 文 献 综述 白质组学研究进展 蛋白质组学的概念 蛋白质组 (名称由澳大利亚的 于 1995 年第一次在 他将之定义为由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质。 现在，该概念得到扩展，即在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平 、翻译后的修饰、 蛋白质的相互作用等，以此获得 在 蛋白质水平上关于疾病发生 、 细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着 组织、甚至环境状态的不同而改变。在转录时，一个基因可以多种 且同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰，例如磷酸化、糖基化等，故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目。而且，基因组在几乎所有的细胞中都是完整的，与之不同，蛋白质组具有很高的细胞特异性，一个有机体的不同细胞表达它的全蛋白的不同亚套。同时，基因组储存了稳定的信息，其成分不随时间变化，而蛋白质组是高度动态的，根据特异的细胞类型和细胞状态而动态表达。蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因 表达的蛋白质水平进行定量的测定，以及解释基因表达调控的机制。 蛋白质组学内容 蛋白质组学研究主要包括蛋白质的表达模式和蛋白质的功能模式两个方面。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容 ,主要是研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。常规的方法是提取蛋白质 ， 经 2 ( 分离形成一个蛋白质组的二维图谱 ,通过计算机图像分析得到各蛋白质的等电点、分子量、表达量等 ， 再结合以质谱分析为主要手段的蛋白质鉴定 ,建立起细 胞或组织或机体在所谓“正常生理条件下”的蛋白质组图谱和数据库。然后 ， 在此基础上 ， 可以比较分析在变化了的条件下蛋白质组所发生的变化 ， 如蛋白质表达量的变化、翻译后的加工修饰、蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等 ， 从而发现和鉴定出特定功能的蛋白质及其基因。 蛋白质功能模式的研究是蛋白质组学研究的重要目标 。 无论是基因组研究还是蛋白质组研究 ,最终目标是揭示所有基因或蛋白质功能及其作用模式 。 一方面 ， 蛋白质与蛋白质、蛋白质与 间的相互作用、相互协调是细胞进行信号传导及代谢活动的基础。另一方面 ， 蛋白质的结构是蛋白质发挥 其功能的前提 ， 对蛋白质结构的认识也成为了解大量涌现的新基因功能的一个重要途径。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文 献 综述 2 根据研究目的的不同 ， 蛋白质组学研究又可以细分为下列领域：表达蛋白质组学（ 指大规模的研究蛋白质表达差异，类似于基因的差异表达分析，它包括细胞或组织的全蛋白表达谱（ 在不同条件下蛋白质的差异表达分析（ in ， 该方面主要借助 2术和图像分析， 可在整个蛋白组水平上研究细胞通路 ； 细胞图谱蛋白质组学（ 它的目的是识别蛋白质的相互作用，阐明细胞内复杂的蛋白网络，该策略对细胞信号传导通路的研究有重要的意义，主要研究方法包括酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术 ； 功能蛋白质组学（ 随着基因组学的深入进行， 1997 年提出了功能蛋白组学的概念，即研究细胞内于某个功能相关或某种条件下的表达的一组蛋白 ； 结构蛋白质组（ 大规模高通量地测定表达蛋白质的三 维结构，在基因组规模上确定蛋白质的三维结构 2， 通过对其结构的了解，以理解其生理功能。 蛋白质组学的研究方法 相对于基因分析而言 , 在一个分析体系内 , 蛋白质的种类十分繁多 , 常常可达 10000 种以上 ,而且不能够体外扩增增加其含量。因此 ,要实现蛋白质组的大规模 ,自动化系统分析 ,研究方法和技术面临很大挑战 ， 需要满足以下要求 : (1) 高效提取和分离所有蛋白质组分 ； (2) 准确鉴别和定量分析每一组分 ； (3) 能够比较分析表达图谱的复杂变化 。 其中蛋白质所有组分的完全分离是蛋白质组研究的前提条件。目前最主要的方法之一是双向凝胶电泳分离复杂 成分 ， 利用专门软件进行图象分析 , 之后采用氨基酸组成分析 , 序列分析 , 质谱分析等技术进行精细鉴定。 向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。 1975 年 O 先建立了等电聚焦 聚丙烯酰胺双向凝胶电泳 ( E) 分离和分析蛋白质组分的技术 3。这一技术应用两个不同分离原理依据蛋白质的特性进行分离 。 第一相依据蛋白质所带电荷量的不同 ， 用等电点( 聚焦技术分离蛋白质。第二相是依据蛋白质分子量大小的差别 , 通过蛋白质与 成复合物后 ， 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速率不同达到分离蛋白质的目的 4。 双向电泳体系有 种 。 O首先提出的是 等电 ,道 尔顿 )， 使用了 9L 尿素、 2 % 4 %T、 5 %C 的管状载体两性电解质(凝胶等电聚焦为第一向。聚焦后在含 用琼脂糖包埋在垂直板状 胶的浓缩胶上 ， 用不连续 度凝胶电泳作二向 ， 用放射自显影方法 ， 得到了 5000 个蛋白点的图谱。 载体两性电解质 度是在电泳过程中形成 ， 度不稳定 ， 受电场和时间影响大 ， 重复性不好 ； 且阴极飘移会造成碱性蛋白质的丢失。因此随着 1982 年固相 度 ( pH 等电聚焦技术的完善 , 步替代了 发展成3。 比有以下优点 : 分辨率高 ， 可达 010001 围灵活 ， 可检测碱性蛋白 ， 并且能得到 12 范围的双向图谱 ； 度是由 价中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文 献 综述 3 结合到凝胶中 ， 在凝胶聚合时形成 ， 不受脱水、泡胀、电场因素影响 ， 度十分稳定 ， 电泳重复性好 ； 上样量大 ， 平衡时蛋白质不易被洗脱 ， 易于转移到第二向胶 ， 因此 成为双向电泳的核 心技术。但是 其导电性比载体两性电解质的导电性低100倍 ,需使用高电压。 随着超灵敏度质谱技术的发展 ， 发现双向凝胶电泳并不能将所有蛋白质完全分离 ， 许多斑点仍为两个或更多蛋白的混合物。此外 ， 在其应用中仍然存在很多局限 : (1) 样品上样量小 ， 使蛋白检测的灵敏度受到限制 ； (2) 电泳结果须经染色处理 ， 不能直接分析 ， 并且不同蛋白质与染料的结合差异较大 ； (3) 分子量过大 ( 100000)或 过小 ( 10000 6 迅速移走上清； 7 再次短暂离心，移走剩余上清； 8 每管加入 100400浮沉淀； 9 加入 1A:B=100： 1混合），倒置混匀； 10室温孵育 15 11以水做空白， 480 12做标准曲线，计算样品的浓度。 注意事项： 1 工作液 4放置一星期，但用前要确保其在 480 2 加入工作液后 15测定吸光值； 3 步骤 6要迅速，以免沉淀复溶，可不完全吸干。 一向固相 度等电聚焦 1. 根据胶条长度、 围、蛋白质溶液浓度计算吸取适量蛋白溶液，用 蛋白 水化液稀释定容到所需上样量 ， 加入到相应型号的胶条槽中。 2. 从酸性端（尖端）一侧剥去 条的保护膜，胶面朝下，先将 阳性端 )朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡， 最后放下条平端 (阴极 )，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。 3. 条上覆盖适量 盖油，盖上盖子。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 材料与方法 16 4. 将标准型胶条槽的尖端背面电极与 器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 器的阴极平台接触。 5. 设置 器运行参数： 条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度（如下所示） 6. 条水化后可自动进行等电聚焦电泳。 7. 等电聚焦完成后， 暂时不进行第二向的 条 可夹在两层塑料薄膜中于 保存几个 9月。 11 水化 50V 1217） 主动水化 250V 线性 30分钟 除盐 1000V 快速 30分钟 除盐 8000V 线性 4小时 升压 8000V 快速 40,000伏小时 聚焦 500V 快速 任意时间 保持 选择所放置的胶条数； 设置每根胶条的极限电流（ 50）；设置等电聚焦时的温度（ 20） 17 水化 50V 1217） 主动水化 250V 线性 30分钟 除盐 1000V 快速 1小时 除盐 10000V 线性 5小时 升压 10000V 快速 60,000伏小时 聚焦 500V 快速 任意时间 保持 选择所放置的胶条数；设置每根胶条的极限电流（ 50）；设置等电聚焦时的温度（ 20）。 条的平衡 1. 使用前 取适量平衡缓冲液 511 1024加入 浓度为1，作为平衡液 。 取出 条分别放入玻璃管中 (支持膜贴着管壁，每个玻璃管中放入一条 条 )， 用 口， 振荡仪上振荡 15分钟，倒掉平衡缓冲液 I。 2. 前取适量平衡缓冲液 511 1024加入碘乙酰 铵，终浓度为 作为平衡液。从平衡液中取出 条，放入平衡液中，用 口，振荡仪上振荡 15 分钟。 3. 取出 条，用去离子水润洗 条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分 钟，去除多余的平衡缓冲液。 4. 条的转移：将 条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将 条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在 条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。 5. 最后用琼脂糖密封液进行封顶，用少量 的密封液（ 约 使 此过程中不要产生气泡。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 材料与方法 17 二向 泳 按仪器说明书装好灌胶模具，倒入凝胶溶液 （见附录），预 先制备 冷循环水浴仪温度设定 12。 开温控系统，调节温度为 12 。 条小心的放置在 面上，并轻压使 条与 面充分结合，上面覆盖 275 ），使琼脂糖在 5分钟内凝固。 通电源，起始时用的低电流（ 5mA/1 功率（ 4，待样品在完全走出 缩成一条线后，再加大电流 （ 201 功率（ 14W/ 4，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 备染色。 胶染色 染 1. 固定： 100 25 加水到 250ml i. 30分钟 或者更长时间 2. 致 敏： 75 17 i. 加水到终体积 25030分钟 3. 水洗： 用 次，每次 5分钟 4. 银染： 100 加水到终体积 250i. 20分钟 5. 水洗： 用 次，每次 1分钟 6. 显色： 100醛 ， 加水到终体积 250ml i. 37. 终止： 加水到终体积 250i. 10分钟 8. 保存： 1% 冰醋酸， 4 注意事项： 保证所有的染色器皿绝对的干净，可使用玻璃 或塑料做染色器皿； 水的纯度对染色结果好坏影响是很大的，至少要用双蒸水（导电率 2 S），有条件的可使用 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 材料与方法 18 染色过程中避免手去接触凝胶，必须戴上一次性手套或无粉乳胶手套； 所用的化学试剂一定是要分析纯（ 良的胶体考染法 1. 固定 : 100 25 加水到 2500分钟或者更长时间 2. 水洗 : 用 次，每次 15分钟 3. 染色 : ( 10% 硫酸铵 , 10% 磷酸 0% 甲醇 ) 过夜 4. 脱色 : 去离子水至背景清楚 泳凝胶图像分析 电泳凝胶通过 100描仪获得图像，凝胶图像经过 D 得蛋白质斑点的等电点、分子量、相对表达丰度以及凝胶之间蛋白质斑点匹配的信息。 蛋白质的分子量根据蛋白质分子量标准在凝胶上的条带位置分别确定标准线，通过软件计算出各蛋白质斑点的分子量。蛋白质等电点根据线性 条的特点，通过软件在 3 4范围内进行等分，获得各蛋白质点的等电点。 蛋白质 的表达丰度是通过蛋白质斑点在凝胶上的体积（ 算出来的。软件设计的算法是通过对每个蛋白质斑点在胶上的实际体积进行均一化处理，计算出其相对体积（ V）， 表了蛋白质的相对表达丰度（ 过下面的公式计算得到，即用每个蛋白质斑点的实际体积值（ 以整块凝胶上全部蛋白质斑点体积值的总和（ ），从而得到每个蛋白质斑点的相对体积（ ）。 只有那些在每 一个样品的三次重复实验中都存在的点才被认为是稳定的蛋白质斑点。只在 对照 样品和 胁迫 样品之一中存在的点被认为是该样品特有的点。将两个样品中稳定存在并能够匹配的点进行相对表达丰度的比较，通过对各点 的进行方差分析后得到的差异显著（ P 点被认为是表达丰度发生变化的点。 D 1. 建立一个工作区 2. 观察和校准凝胶 3. 检定和定量蛋白点 4. 注释蛋白点和象素： 5. 匹配凝胶图像 6. 分析数据 7. 整合数据 8. 报告结果 1 nn 1 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 材料与方法 19 9. 控制和自动化凝胶分析 白质凝 胶斑点切取 本实验中 凝胶斑点 主要 用手工制作的切胶笔手工切取。 有条件的情况下， 蛋白质凝胶斑点的切取 可以 通过蛋白质凝胶斑点切取仪（ 成， 将需要切取的蛋白质斑点的坐标值在软件中列表，切取仪将按照列表逐一切取凝胶并按顺序放到指定的 96孔板