微生物检验衣原体及检验.doc

第二十七章衣原体及检验本章考点：1.概述（1）概念（2）命名与分类2.生物学性状（1）繁殖周期与形态染色（2）抗原成分（3）分离培养（4）抵抗力3.临床意义（1）沙眼衣原体（2）鹦鹉热衣原体（3）肺炎衣原体4.微生物学检验（1）直接镜检（2）抗原检测（3）核酸检测（4）分离培养（5）抗体检测5.治疗原则概述一、概述（一）概念衣原体是一群体积较小，能通过细菌滤器，细胞内专性寄生，并有独特发育周期的原核细胞型微生物。由于它具有一些与细菌类似的生物学特性，现归属于广义的细菌范畴。（二）分类与命名1.传统分类法：按第九版Bergey细菌学分类手册，衣原体属于衣原体目、衣原体科、衣原体属。二、生物学性状1.发育繁殖周期与形态染色：衣原体在宿主细胞内生长繁殖有独特的发育周期，可见到两种形态结构不同的颗粒。（1）原体：呈球形或椭圆形，直径约0.3m，外有胞壁，内含致密的核质，为成熟的衣原体。姬姆萨染色呈紫色，Maechiavello染色呈红色。在细胞外较为稳定，无繁殖能力，但有高度的感染性。（2）网状体又称始体：呈球形或椭圆形，直径0.51m，无胞壁，胞浆内无致密的核质，而有纤细的网状结构。姬姆萨染色和Maechiavello染色均呈蓝色。为衣原体发育周期中的繁殖型，代谢活泼，不能自胞外存活，无感染性。衣原体原体和始体的性状比较性状原体始体大小0.3m0.51m细胞壁+-致密的核质+-姬姆萨染色紫色蓝色Maechiavello染色红色蓝色代谢活性-+胞外稳定性+-感染性+-繁殖能力-+衣原体的发育周期：2.抗原成分：衣原体的抗原性相当复杂，有属、种、型等特异性抗原。（1）属特异性抗原：衣原体细胞壁LPS为属特异性补体结合抗原。其与革兰阴性菌LPS结构不同，缺乏O-多糖和部分核心多糖，无典型内毒素生物学活性。长期应用于衣原体血清学诊断。（2）种特异性抗原：位于主要外膜蛋白（MOMP）上，可鉴别不同种衣原体。（3）型特异性抗原：也位于MOMP上，用单克隆抗体作微量免疫荧光试验可识别衣原体各血清型。3.分离培养特性：衣原体专性细胞内寄生。绝大多数能在68日龄鸡胚卵黄囊中生长繁殖，并可在卵黄囊膜中找到包涵体、原体和始体颗粒，也可在传代细胞（如He-La-299和McCoy等细胞株）中培养。4.抵抗力：衣原体抵抗力弱，沙眼衣原体感染材料在3537条件下，经48小时左右即失去活性。不耐热，加热50经30分钟或5660 510分钟可杀死，但耐寒，在冰冻条件下可存活数年。鹦鹉热衣原体比沙眼衣原体稳定。对四环素、青霉素、红霉素、螺旋霉素、利福平较敏感。三、临床意义人类衣原体病主要包括：（一）沙眼衣原体1.沙眼：由沙眼生物亚种A、B、Ba和C四个血清型引起。主要通过眼-眼或眼-手-眼（常通过公用毛巾等媒介）的途径进行直接或间接接触传播。2.包涵体结膜炎：由沙眼生物亚种B、Ba、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K血清型引起。包括婴儿及成人两类。婴儿经产道时该亚种可致包涵体（化脓性）结膜炎和婴幼儿肺炎。成人引起滤泡性结膜炎。3.泌尿生殖道感染：主要由沙眼生物亚种D-K血清型引起，是经性接触传播引起的非淋菌性泌尿生殖道感染的主要病原。衣原体感染是男性尿道炎最常见的病因之一。未经治疗者多数转为慢性，周期性加重，或可合并附睾炎、前列腺炎等。在女性可引起尿道炎、宫颈炎、阴道炎、盆腔炎，也可与妇女不孕症有关。衣原体常与淋病奈瑟菌混合感染，淋病奈瑟菌对衣原体的繁殖起激活和促进作用。4.性病淋巴肉芽肿：由沙眼衣原体LGV生物亚种L（L1、L2、L2a、L3）血清型引起，主要通过性接触传播。引起以化脓性腹股沟淋巴结炎为特征的性病，又称第四性病。主要侵犯淋巴组织，女性以累及会阴、肛门、直肠及盆腔淋巴结多见，男性以累及腹股沟淋巴结为常见，发生化脓性炎症和慢性肉芽肿，有些可形成瘘管。（二）鹦鹉热衣原体主要引起鸟类或家禽感染，由感染该衣原体的鸟类等动物的粪便污染环境，以气溶胶形式传给人。使人发生上呼吸道感染、肺炎和毒血症。典型临床表现为非典型肺炎。也有引起心内膜炎的报道。（三）肺炎衣原体其传播方式主要是人与人之间经飞沫或呼吸道分泌物传播。引起青少年急性呼吸道感染，以肺炎为主，常可呈地方性、散发性流行，也可引起支气管炎、咽炎等。该衣原体也可引起慢性感染，其与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系越来越引起注意。四、微生物学检验1.标本采集与处理（1）沙眼衣原体：沙眼和包涵体结膜炎的病人，取眼穹隆部及睑结膜病灶作刮片。子宫颈炎，取子宫颈刮片上皮细胞或分泌物作涂片。性病淋巴肉芽肿病人可取腹股沟淋巴结脓液，也可取直肠拭子或活检材料送检。（2）鹦鹉热衣原体：采取病人血液、痰或咽喉含漱液，痰标本用约210倍左右的灭菌肉汤或组织培养液洗脱附着在标本上的病原体，用力振摇，制成悬液，置室温12小时后，低速离心取上清接种。尸检材料取肝、脾、肺等组织，也可采腹腔和心包渗出液。（3）肺炎衣原体：一般利用拭子经鼻前庭插入鼻咽部，旋转后取出，利用转运培养基，冷藏送检。也可采集气管内痰液或肺泡灌洗液。要求24小时内接种或置-70保存。2.直接显微镜检查：染色镜检，寻找上皮细胞细胞浆内的包涵体。根据包涵体的形态、在细胞内的位置及染色性等特性，对鉴别衣原体有意义。（1）姬姆萨（Giemsa）染色：原体呈紫红色，始体呈蓝色，包涵体呈深紫色。（2）碘液染色：标本经甲醛固定后，用Lugol碘液染10min，水洗后镜检。因包涵体的基质含有丰富的糖原，可被碘液染成深褐色，而细胞的其他部分呈黄色。沙眼衣原体含糖原，碘染色阳性。鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体碘染色阴性。（3）可利用抗LPS单抗进行直接法荧光抗体染色检测上皮细胞内的衣原体抗原。3.分离培养：各种衣原体均可在鸡胚卵黄囊和组织细胞内生长繁殖，鹦鹉热衣原体常用小鼠分离。（1）鸡胚卵黄囊接种：将检查标本加适当抗生素（如链霉素等）处理后接种于鸡胚卵黄囊分离培养。（2）细胞培养：目前常用的细胞有两种：即经X线照射的McCoy细胞和HeLa细胞。不同种的衣原体有各自最适合的培养细胞系。沙眼衣原体多用McCoy细胞，鹦鹉热衣原体适合用Hela 229细胞系进行培养。肺炎衣原体适合用HEP-2和HL细胞系进行培养。为了达到较好的培养效果，可对细胞系进行一定处理，可以用DEAE葡聚糖预处理，以便增加分离率，也可以用细胞生长抑制剂，抑制宿主细胞生长，以利于衣原体的分离培养。（3）小白鼠接种：小白鼠对不同种衣原体的敏感性不同，对沙眼衣原体不敏感，主要用于鹦鹉热衣原体的分离。用小鼠腹腔、颅内或滴鼻接种。4.核酸检测：按MOP0基因序列或其他具有种、型特异性的核酸片段，构建特异性引物或探针，利用PCR、核酸探针技术进行检测。按16SrRNA基因序列设计引物一般具有属特异性。5.检测抗原：可检测临床标本中的可溶性抗原。酶免和荧光免疫法等。6.检测抗体：用补体结合试验、微量免疫荧光法、酶免法检测抗体。五、治疗原则四环素类及大环内酯类对衣原体有较高的活性，青霉素类、磺胺、氧氟沙星以及利福平等也有一定的活性，磺胺对肺炎衣原体无效。孕妇、哺乳期妇女以及儿童禁用四环素而首选红霉素。本章练习题：衣原体具有高度感染性的阶段是A.原体B.始体C.包涵体D.吞噬体E.溶原体答疑编号500735270101正确答案A可引起性传播疾病的是A.沙眼衣原体B.钩端螺旋体C.立克次体D.鹦鹉热衣原体E.密螺旋体雅思亚种答疑编号500735270102正确答案A 新生儿眼结膜内检查包涵体最有诊断意义的是A.弓形虫感染B.先天性梅毒C.巨细胞病毒感染D.疱疹E.沙眼衣原体感染答疑编号500735270103正确答案E 可用于沙眼的辅助诊断的是A.外斐试验B.显微镜凝集试验C.墨汁染色D.包涵体检查E.冷凝集试验答疑编号500735270104正确答案D 衣原体在宿主细胞内生长繁殖有独特的发育周期，下列不包括A.原体B.始体C.包涵体D.溶原体E.吞噬体答疑编号500735270105正确答案CDE第二十八章立克次体及检验本章考点：1.概述立克次体共同特征与分类2.生物学特性（1）形态与染色（2）抗原构造（3）培养特性3.致病性概述4.微生物学检验（1）标本的采集（2）直接检查（3）分离培养（4）血清学检测一、概 述立克次体是一类严格寄生在细胞内的原核细胞型微生物。立克次体的共同特征：大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出血性疾病。以节肢动物为传播媒介或储存宿主；大小介于一般细菌与病毒之间，革兰染色阴性，呈多形性主要为球杆状；除极少数外均专性活细胞内寄生；对多种抗生素敏感。菌体内同时含有DNA和RNA；以二分裂方式进行繁殖。对人类致病的立克次体有五个属：立克次体属、柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴通体属。立克次体属分为2个生物型：斑疹伤寒群、斑点热群。原有的立克次体属恙虫病群已另立为东方体属，罗沙利马体并入巴通体属，柯克斯体属的生物型是Q热。二、生物学特性1.形态与结构：立克次体形似小杆菌，大小为（0.82.0）m（0.30.6）m，具有程度不同的多形性。可出现球杆状，有时呈丝状，无鞭毛或荚膜。革兰染色阴性，但一般不易着色，常用Giemsa、Macchiavello和Gimnez法染色，Giemsa染呈紫红色，常显两端浓染，Maechiavello染呈红色，Gimnez法染呈红色，背景为绿色。立克次体的结构与革兰阴性菌非常相似，脂类含量比细菌多，细胞壁弹性较大。各种立克次体在细胞内存在部位有所不同，以此可作初步鉴别。立克次体定位普氏立克次体胞质中恙虫病立克次体胞质近核处Q热立克次体胞质的空泡中斑点热立克次体胞质外，核内埃立克体宿主细胞膜包被的空泡内2.抗原组成构造：立克次体有两类特异性抗原：群特异性和种特异性。群特异性抗原是立克次体悬液经乙醚处理后获得的可溶性抗原。种特异性抗原，为颗粒性抗原。斑疹伤寒等立克次体与变形杆菌某些X株的菌体抗原（OX19、0X2、OXK抗原）具有共同的耐热性多糖类属抗原，因而临床上常用后者代替相应的立克次体抗原进行非特异性凝集反应，作为人类或动物血清中有关抗体的检查。这种交叉凝集试验称为外斐反应，用于立克次体病的辅助诊断。3.培养特性：除巴通体外，其他立克次体只能在活的真核细胞内生长。立克次体的分离繁殖常用方法有鸡胚卵黄囊培养、细胞培养。接种豚鼠等动物可用于立克次体的初代分离。汉赛巴通体接种新鲜巧克力平板，在35、5%CO2环境中培养2周左右才长出菌落。三、致病性立克次体病以发热、头痛、皮疹及中枢神经系统症状为其特征。发热多为稽留热，伴剧烈头痛、肌肉痛；可伴恶心、呕吐；皮疹可为充血性皮疹或出血性皮疹；严重时可累及中枢神经系统，出现神志不清、昏迷等症状。立克次体传播媒介所致疾病立克次体斑疹伤寒群普氏立克次体体虱流行性斑疹伤寒莫氏立克次体鼠蚤或鼠虱地方性斑疹伤寒恙虫病立克次体恙螨幼虫恙虫病贝纳柯克斯体（又称Q热立克次体）蜱或通过接触、呼吸道、消化道等途径Q热。以出现肺炎和肝炎为其临床特征汉赛巴通体猫抓伤、咬伤杆菌性血管瘤-杆菌性紫癜和猫抓病四、微生物学检验由于立克次体的传染性较强，许多立克次体实验室均曾发生过实验室感染，因此每个实验室必须有专门培训过的技术人员，还要有严格隔离防护措施和各项操作制度。实验室工作者应首先接种疫苗，必要时进行药物预防，以防止实验室感染的发生。（一）标本的采集和处理1.病人血液：在发病初期或急性期较易检出病原体。在病程第一周内并在使用广谱抗生素前采集患者血液510ml，立即在患者床边接种于动物。血清学检查标本一般采集3份血液标本，分别取自病程早期、病后1014天及病后2128天。如患者已使用抗生素治疗，因抗体产生较晚，故需采集第4份标本。2.活检或尸检材料：肺、肝、脾等组织标本研磨制成10%20%悬液，低速离心取上清接种，若标本有细菌污染，可加青霉素（1001000IUml）置室温作用30min后接种动物。（二）标本直接检查1.立克次体的染色法：多用于脏器标本的检查。标本印片、固定后用荧光抗体染色或常规染色镜检。必要时作切片检查。2.核酸检测：针对特异性抗原基因的序列设计引物，采用PCR技术和核酸探针检测。（三）立克次体培养法1.立克次体分离：斑疹伤寒、斑点热、恙虫病和Q热病原体分离多用动物接种。常用动物有豚鼠、金黄地鼠、小白鼠、大白鼠及家兔等。汉赛巴通体用人工培养基，埃立克体用细胞培养。2.分离株的大量繁殖及保存用鸡胚卵黄囊培养或细胞培养。（四）血清学试验血清学试验是研究立克次体的重要方法，也是立克次体病实验诊断和鉴定病原体的重要手段。病人双份血清的试验结果，有利于立克次体病现症诊断。1.间接免疫荧光（IFA）试验、ELISA间接法是目前检测标本中特异性抗体的常用方法。间接微量免疫荧光技术的方法敏感，重复性好，又节省材料和时间，因而在血清学诊断及立克次体种别鉴定上广泛应用。单份血清滴度1：128者有现症诊断意义，一般滴度在1：16或以上即为阳性，4倍增长可作为立克次体病的现症诊断。2.凝集试验：分为特异性凝集和非特异性凝集试验两种，具体方法如下：（1）特异性凝集试验：微量血凝试验（MA）、间接血凝试验（IHA）、乳胶凝集试验（LA）。MA以血清最高稀释度呈凝集者为其滴度，达1：8以上者为阳性。IHA滴度在1：50以上有诊断价值。LA结果与IHA结果相吻合。（2）非特异性凝集试验：外斐试验常用于立克次体属的三个生物型的诊断，缺乏敏感性和特异