SDS page及tricine蛋白电泳.docx

1.1 蛋白质电泳 SDS-PAGE1.1.1 溶液配制Tris 缓冲液 （1.5 M， pH 8.8）90.86 g Tris 溶于400 ml 水中，加HCl调pH至8.8，定溶至500 ml。Tris 缓冲液 （1.0 M， pH 6.8）60.57 g Tris 溶于400 ml 水中，加HCl调pH至6.8，定溶至500 ml。30% 丙烯酰胺29 g 丙烯酰胺1 g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于60 ml水（可用37 水浴溶解），定溶至100 ml，过滤后装入棕色瓶，放置4 保存。10% SDS20 g SDS溶于200 ml水。5 Tris 甘氨酸缓冲液15.5 g Tris （1: 25 mM）94 g 甘氨酸（1: 250mM）5 g SDS （1: 0.1%） 或者加50 ml 10% SDS溶液定容至1 L，使用时稀释5倍。5SDS-PAGE Loading Buffer 1.25 ml 1M Tris-HCl pH6.8（终浓度：250 mM）0.5 g SDS （终浓度：10%）25mg 溴酚蓝（终浓度：0.5%）2.5 ml 甘油（终浓度：50%）350 mg 二硫苏糖醇DTT（终浓度约为500 mM） 加入去离子水溶解后定容至5 ml，小份（500 l）分装，低温保存。5SDS-PAGE Loading Buffer0.6 ml 1M Tris-HCl pH6.8（终浓度：60 mM）2 ml 10%SDS （终浓度：2%）1ml 1%溴酚蓝（终浓度：0.1%）5 ml 50%甘油（终浓度：25%）0.5 ml 巯基乙醇（终浓度约为14.4 mM） 加入去离子水溶解后定容至10 ml，小份（500 l）分装，低温保存。2SDS-PAGE Loading Buffer 1.25 ml 1M Tris-HCl pH6.80.2 g SDS 0.25 ml 巯基乙醇2.5 ml 甘油0.05 ml 2% 溴酚兰 （溶于乙醇）1.9 ml H2O定容至10 ml，小份（500 l）分装，低温保存。5SDS-PAGE Loading Buffer （非还原）0.4 ml 1.5 M Tris-HCl pH8.82 ml 10% SDS10 mg 溴酚蓝2.5 ml 甘油5.1 ml H2O定容至10 ml，小份（500 l）分装，低温保存。染色液 （100 ml）45 ml 甲醇 or 乙醇10 ml 乙酸0.25 g Coomassie Brilliant Blue R-250定容至100 ml。洗脱液30% 甲醇 or 乙醇10% 乙酸1.1.2 制胶配方15% 分离胶 （10 ml）2.3 ml 水5.0 ml 30% 丙烯酰胺溶液2.5 ml 1.5 M Tris（pH 8.8）0.1 ml 10% SDS0.1 ml 10% APS0.005 ml TEMED5% 积层胶（4 ml）2.7 ml 水0.67 ml 30% 丙烯酰胺溶液0.5 ml 1.0 M Tris（pH 6.8）0.04 ml 10% SDS0.04 ml 10% APS0.004 ml TEMED1.1.3 电泳操作制胶：1. 先注入分离胶，预留出分离胶空隙，加水（或异丙醇）将胶面压平。2. 待分离胶凝固后，吸去水（或异丙醇）注入积层胶，放入梳子，待凝固后摘掉梳子。电泳：3. 在电泳槽底部加入缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入缓冲液。4. 上样，加marker。5. 开始电泳。电压80 V。当蓝色染料从积层胶进入分离胶后，电压加到120 V。6. 继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。染色：7. 取出所需胶体，浸泡在考马斯亮蓝染色剂中染色（放置在摇床上）1小时以上回收染色剂，倒入洗脱液退色。1.2 Tricine SDS-PAGE1.2.1 溶液配制正极缓冲液anode buffer（1）0.2 M Tris (pH 8.9)：12.114 g加H20定容至500 ml, 4 保存。负极缓冲液 cathode buffer（1） 0.1 M Tris + 0.1 M Tricine + 0.1% SDS 不用调pH：6.057 g Tris + 8.96 g Tricine + 0.5 g SDS 加H20定容至500 ml, 4 保存。凝胶缓冲液 gel buffer（G-B, 3）36.342 g Tris + 0.3 g SDS加H20定容至100 ml, HCl调pH = 8.45， 过滤4 保存。AB-3 储存液（49.5% T, 3% C mixture）24 g丙烯酰胺 + 0.75 g甲叉双丙烯酰胺，加H20定容至50 ml，过滤4 保存。AB-6储存液（49.5% T, 6% C mixture）23.25 g丙烯酰胺 + 1.5 g甲叉双丙烯酰胺 加H20定容至50ml，过滤4 保存。1.2.2 制胶配方10% 分离胶 （8 ml）1.6 ml AB-62.67 ml 3 gel buffer1 ml 50%甘油2.73 ml 水0.04 ml 10% APS0.004 ml TEMED4% 积层胶（4 ml）0.33 ml AB-31 ml 3 gel buffer2.67 ml 水0.03 ml 10% APS0.0033 ml TEMED1.2.3 电泳操作制胶同SDS-PAGE。电泳：1. 在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液。2. 用30 V的电压预电泳10分钟，然后上样。3. 开始电泳。电压30 V。当蓝色染料从积层胶进入分离胶后，电压加到90 V。其他步骤同SDS-PAGE。1.3 蛋白质沉淀 （protein precipitation）1.3.1 丙酮沉淀蛋白质1. 纯丙酮放置在-20 预冷5 h。2. 1体积的蛋白样品加入4体积的冰冻丙酮，混合后放置于-20 20 min（蛋白浓度低可延长冷冻时间）。3. 4 ， 15000 g 离心15 min，小心移出上清，保留沉淀。将离心管倒置晾干残留丙酮。4. 取微量水重溶沉淀。（若使用乙醇沉淀蛋白，1体积的蛋白样品加入9体积的冰冻乙醇。步骤3后清洗沉淀1次。）1.3.2 硫酸铵沉淀蛋白质1. 1体积的蛋白样品加入1体积的饱和(NH4)2SO4，终饱和度为50%（约2 M）或70%（约3.2 M）。混合后放置于 4 3h（蛋白浓度低可延长冷冻时间）。2. 4 ， 15000 g 离心15 min，小心移出上清，保留沉淀。将离心管倒置晾干残留液。3. 取微量水重溶沉淀。1.3.3 三氯乙酸TCA沉淀蛋白质1. 准备100% TCA溶液：以454 ml 水溶解1 kg TCA。制备时须戴手套！避光4保存。2. 蛋白样品中加入100% TCA溶液，使TCA终