微生物遗传结合转移教程教案

微生物遗传结合转移教程教案 细菌质粒的接合转移三亲本杂交实验原理 1、质粒的转移性?细菌的遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。 接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从供体向受体转移的过程。 ?质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有完整的编码转移酶的tra基因,质粒能自主地从一个细胞转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。 如大肠杆菌的F质粒。 ?有些质粒不含tra基因,但含有质粒转移起始位点oriT，虽不能自主转移，但能被其他一些含完整tra基因的质粒所诱动,这类质粒又被叫做可诱动质粒。 实验原理 2、本实验所用供体质粒?本实验中要转移的质粒是pHN102，它是在广宿主范围的稳定载体pTR102中插入生物发光酶基因luxAB构建而成。 ?pTR102中带有含par基因的稳定性片段（stabillty）,它能在较多革兰氏阴性细菌中稳定存在，它含有质粒转移起始位点oriT，不含完整的转移基因tra，必须在含有tra基因的辅助菌株诱动下，pTR102才能从供体菌向受体菌转移。 ?为有效筛选转移接合子(transconjugant),pHN102质粒上带有Tc抗性和生物发光酶基因(lux AB）两个标记。 加入lux AB的底物癸醛（Decanal）后，菌体可发出微弱荧光。 实验准备?菌株活化（教师做）将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期E.coli(pTR102-luxAB):液体LB+Tc20g/ml,37O C震荡培养1夜；S.fredii:TY液体,28O C震荡培养2天；E.coli(pPK2073):液体LB+Spe50g/ml,37O C震荡培养1夜?倒平板（学生做）?第 1、2组倒不加Tc的SM（平皿上标记“纯SM”）融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml（装在1.5ml离心管中，标记“维”)，混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。 凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室（4O C）备用。 ?第 3、4组倒TY平板融化1瓶TY固体,倒平板12-13个,凝固后分发到4个超净台使用。 ?第 5、6组倒SMTc平板（平皿上标记“SMTc”）融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml和四环素0.5ml（Tc,10mg/ml,装在1.5ml离心管中，标记“Tc”），混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。 凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室(4O C)备用。 操作步骤三菌混合培养（第1天） (1)吸取供体菌、辅助菌各0.4ml，吸受体菌0.6ml，都加入同一个1.5ml离心管内（每个同学做1管），8000转/min离心1分钟。 (2)倒上清，向沉淀加1ml的TY液体，用tip上下抽吸，洗涤菌体，再8000转/min离心1分钟，倒上清，留沉淀。 (3)用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的TY平板上（每个同学1片，3片/平板，平皿背面标记姓名），用200l的tip抽吸离心管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外） (4)加好菌液后，静置510分钟，待滤纸上的培养基液体被平板吸收后，倒置放培养箱，28O C培养1天。 操作步骤洗菌涂平板（第2天） （1）灭菌小PA瓶中加5ml无菌水(1瓶/人),镊子揭下TY平板上的滤纸片，放入瓶中，在震荡混匀器上充分打散菌体。 （2）向1.5ml管加0.9ml无菌水,加0.1ml已打散的菌液,混匀。 （3）吸已稀释的菌液分别涂布于昨日倒的SM+Tc平板和不加Tc的纯SM上（每个同学各涂1板，200l/板） （4）放28O C培养6-7天，下周看结果在暗