医学标书范本之T-CADHERIN基因失活与原发性肝癌恶性生物学特.doc

您现在不能请根据以下1)如果您是请把 Word方法: Word 菜单-工具-宏-安全性检查保护国家自然科学基金申 请 书资助类别：亚类说明：附注说明：项目名称：申 请 者：依托单位：通讯地址：邮政编码：电子邮件：申报日期：电话：单位电话：2004 年 3 月 9 日国家自然科学基金委员会申请代码：检查保护文档或打印文档，受理部门：三个步骤操作：收件日期：Word2000或以上版本用户，受理编号：宏的安全性设为:中国家自然科学基金申请书基本信息 yEKHuo0AOsK第 2 页版本 1.009.485申请者信息姓 名在此录入修改性别出生年月年 月民 族学 位职称主要研究领域电 话电子邮件传 真个人网页工作单位在研项目批准号依托单位信息名 称华中科技大学代 码43007402联 系 人张婷姣电子邮件电 站地址合作单位信息单 位 名 称代 码美国华盛顿大学00000000在此录入修改项目基本信息项目名称T-cadherin基因失活与原发性肝癌恶性生物学特征的关系及其临床意义资助类别面上项目亚 类 说 明自由申请项目附注说明申请代码C03030303:普通外科学C03031901:实验肿瘤学基地类别预计研究年限2005 年 1 月 2007 年 12 月研究属性应用基础研究摘要项目研究内容和意义简介（限 400 字）：细胞粘附分子 T-cadherin（T-cad）基因在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中因启动子甲基化而失活，其表达显著下降或缺失，推测其可能为一新的肿瘤抑制基因。申请人首次证实 T-cad 基因在脑胶质母细胞瘤 C6 细胞中的肿瘤抑制基因功能，并揭示其分子机制。本研究将在肝癌细胞株进一步研究 T-cad 基因失活与肝癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的关系，并调查其分子机制；在临床切除的肝癌标本中研究 T-cad 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，明确 T-cad 基因失活与临床肝癌预后的关系；在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化药物是否能重新诱导 T-cad 分子表达并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征，探索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。关 键 词(用分号分开，最多 5 个)T-cadherin；肿瘤抑制基因；肝癌国家自然科学基金申请书项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏)说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者。第 3 页版本 1.009.485编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）1在此录入修改2在此录入修改3在此录入修改4在此录入修改5在此录入修改6在此录入修改7在此录入修改8在此录入修改9在此录入修改总人数高级中级初级博士后博士生硕士生10321121国家自然科学基金申请书经费申请表（金额单位：万元）第 4 页版本 1.009.485科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费17.50001.科研业务费2.9000（1）测试/计算/分析费0.5000统计分析及数据处理费（2）能源/动力费0.4000水电费（3）会议费/差旅费1.0000参加国内学术会议 4-5 人次（4）出版物/文献/信息传播费1.0000论文准备及发表（5）其它2.实验材料费5.5000（1）原材料/试剂/药品购置费4.0000购置各种抗体、脂质体（2）其它1.5000购买氚标胸腺嘧啶、去甲基化试剂、合成引物3.仪器设备费4.5000（1）购置3.0000购买小型冰冻切片机、动物解剖器材及消耗性器材（2）试制1.5000各种常规试剂4.实验室改装费2.0000建立动物解剖工作台及同位素实验专区5.协作费2.6000委托动物中心维持约 100 只裸鼠约 1 年的饲养及管理；流试细胞仪分析二.国际合作与交流费3.50001.项目组成员出国合作交流1.0000参加国际会议一次2.境外专家来华合作交流2.5000邀请 Gutmann 教授来院指导课题进展及专题讲座2-3 次三.劳务费四.管理费1.0000合 计22.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000国家自然科学基金申请书查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容1、项目的立项依据原发性肝癌是高度恶性的肿瘤，尽管采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍难免死于肿瘤复发及转移，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。研究已表明肝癌的发生乙肝、丙肝感染及摄入黄曲霉素污染的食物有密切关系 , 其发生发展与多种癌基因过度表达，以及肿瘤抑制基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此, 进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶性特征的关系，对揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后， 进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。T-cadherin 分子属细胞粘附分子 cadherin 超家族。 Cadherin 超家族分子为细胞表面糖蛋白，其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细胞极性及形态形成，以及参与细胞间的识别和信号传导机制 (1,2,3,4)。经典的 Cadherin 分子如 E-cadherin 和N-cadherin 由细胞外钙结合区及跨膜区两部分组成，而 T-cadherin 因缺失经典Cadherin 分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上（5）,故而命名truncated-cadherin（即 T-cadherin，又称 CDH13 或 H-cadherin）。近年来对经典的Cadherin 分子的深入研究发现，E-，N-cadherin 分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关（6，7，8,9,10）。将 E-cadherin 分子重新导入缺失 E-cadherin 分子表达的肿瘤细胞，则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著受抑（11）。近年已开始有 T-cadherin 分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌及皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导（12，13，14，15,16,17,18），推测 T-cadherin分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能及其分子机制进行研究。2003 年，申请人（黄志勇）最新研究表明，将 T-cadherin 基因 导 入 缺 失 表 达 T-cadherin 分 子 的 大 鼠 脑 胶 质 母 细 胞 瘤 C6 细 胞 使 其 过 度 表 达T-cadherin 分子，C6 细胞的增殖及侵袭能力显著受抑，首次证实 T-cadherin 在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并进一步揭示其抑制机制是 T-cadherin 分子通过诱导 P21 CIP1/WAF1 表达致使肿瘤细胞于细胞周期 G2 期阻滞。该文发表于 Molecularand Cellular Biology 2003,23:566-578（19）。这一研究发现为进一步研究 T-cadherin第 5 页版本 1.009.485国家自然科学基金申请书分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠定了坚实的基础。肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的发病机制中起着重要作用（20，21，22，23）。T-cadherin 基因在乳腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变，但由于其启动子异常甲基化导致 T-cadherin 基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺失（13,16,24）。T-cadherin 基因位于染色体 16q24，肝癌的发生与染色体 16q24 的缺失、突变密切相关(25)。 Riou （2002）对位于染色体 16q24 的 13 个常常在肝癌中缺失表达的基因的转录研究发现，T-cadherin mRNA 在 HepG2, PLC/PRF/C, TONG 和 HA22TNGH四种肝癌细胞株中缺失表达，但 T-cadherin 基因本身并未发生缺失突变（12）。Yu（2002）进一步研究显示 T-cadherin 基因启动子在肝癌中高度甲基化，而 E-cadherin 基因启动子在肝癌中不发生甲基化，表明在 Cadherin 细胞粘附分子超家族中 T-cadherin 基因启动子甲基化在肝癌中具有高度特异性,且 T-cadherin 基因启动子甲基化与 T-cadherin 基因失活密切相关（26）。这些研究表明 T-cadherin 基因启动子甲基化是 T-cadherin 基因在肝癌中失活的主要机制。Takeuchi 在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现，与 2ug/ml 去甲基化药物 5-aza-2-deoxycytidine 共孵 6 天能使皮肤鳞癌细胞株恢复 T-cadherin 分子表达（17）。但目前对 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导 T-cadherin 分子在肝癌细胞株中重新表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。本研究将进一步研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能，调查缺失表达 T-cadherin 的肝癌细胞株重新表达 T-cadherin 是否能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，并在裸鼠肝癌模型上加以证实。同时，进一步研究其基因功能的分子机制。在临床切除的肝癌标本中研究 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，进一步揭示 T-cadherin 基因失活与临床肝癌预后的关系。在肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲基化药物能重新诱导 T-cadherin 分子表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其潜在的治疗作用和可能的毒副作用。由于国内外尚无类似研究报道，申请人具有研究 T-cadherin 基因与 C6 细胞恶性生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预期该研究成果能达国际先进水平。主要参考文献：1. Angst BD, Marcozzi C and Magee AI. The cadherin superfamily: diversity in form andfunction. J Cell Sci., 2001, 114:629-641第 6 页版本 1.009.485国家自然科学基金申请书2. Kemler R. Classic cadherins. Semin. Cell Biol., 1992,3:149-1553. Koller E, Ransch B. Differential targeting of T- and N-cadherin in polarized epithelial cells.J Biol Chem.,1996,271:30061-300674. Takeichi M.Cadherin cell adhesion receptor as a morphogenetic regulator. Science1991,251:1451-14555. Angst, B.D., Marcozzi, c., and Magee, A.L. The T-cadherin superfamily: diversity in fromand function. J.Cell Sci 2001, 114:629-6416. Berx, G., and. Van Roy, F. The E-cadherin/catenin complex: an important gatekeeper inbreast cancer tumorigenesis and malignant progression. Breast Cancer Res. 2001,3:289-293.7. Bremnes, R. M., Veve R., Gabrielson, E. et al. High-throughput tissue microarray analysisused to evaluate biology and prognostic significance of the E-cadherin pathway innon-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 2002,20: 2417-2428.8. Handschuh, G., Candidus S., Luber B., et al. Tumour-associated E-cadherin mutations altercellular morphology, decrease cellular adhesion and increase cellular motility. Oncogene1999, 18:4301-4312.9. Levenberg, S., Yarden A., Kam Z., et al. p27 is involved in N-cadherin-mediated contactinhibition of cell growth and S-phase entry. Oncogene 1999,18: 869-876.10.Altered expression of E-cadherin in hepatocellular carcinoma : correlation with geneticalteration, beta-catenin expression, and clinical features. Hepatology 2002,36:692-70111.Vleminckx, K., Vakaet L., Mareel Jr. M., et al. Genetic manipulation of E-cadherinexpression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppressor role. Cell 1991,66:107-119.12. Riou P, Saffroy R, Comoy J, et al. Investigation in liver tissues and cell lines of thetranscription of 13 genes mapping to the 16q24 region that are frequently deleted inhepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res. 2002 Oct;8(10):3178-86.13. Sato, M., Mori, Y., Sakurada, A., et al. The H-cadherin(CDH13)gene is inactivated inhuman lung cancer. Hum Genet 1998,103:96-10114. Lee, S.W. H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and diminishedexpression in human breast cancer. Nat. Med 1996,2:776-78215.Zhong,Y., Delgado, Y., Gomez, J., et al. Loss of H-cadherin protein expression in humannon-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity. Clin. Cancer Res第 7 页版本 1.009.485国家自然科学基金申请书2001,7:1683-168716.Toyooka S, Toyooka KO,Harada K, et al. Aberrant methylation of the CDH13(H-cadherin)promoter region in colorectoral cancers and adenomas. Cancer Res 2002,62:3382-338617.Takeuchi T, Liang SB, Matsuyoshi N, et al. Loss of T-cadherin(CDH13, H-cadherin)expression in cutaneous squamous cell carcinoma. Laboratory Investigation 2002,82:1023-102918.Kawakami M,Staub J,Cliby W ,et al. Involvement of H-cadherin(CDH13) on 16q in theregion of frequent deletion in ovarian cancer. 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Loss of expression and abrrent methylation oftheCDH13(H-cadherin)geneinbreastandlungcarcinomas.,CancerRes2001,61:4556-456025.Marchio A, Meddeb M, Pineau P, et al. Recurrent chromosomal abnormalities inhepatocellular carcinoma detected by comparative genomic hybridization.Genes Chromosomes Cancer. 1997,18:59-65.26.Yu J, Ni M, Xu J, et al. Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of geneswhich may contribute to hepatocellular carcinogenesis. BMC Cancer 2002, 2:292、项目的 研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题一、研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能第 8 页版本 1.009.485国家自然科学基金申请书1.将 T-cadherin 基因导入缺失表达 T-cadherin 的肝癌细胞株 HepG2，使其表达 T-cadherin分子，研究表达 T-cadherin 分子的肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的变化，证实是否 T-cadherin 重新表达能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征。2.将缺失表达 T-cadherin 的 HepG2 细胞和转染后表达 T-cadherin 的 HepG2 细胞于皮下接种裸鼠，在裸鼠肝癌模型上进一步证实 T-cadherin 基因的肿瘤抑制基因功能。3研究 T-cadherin 基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制。证实是否 T-cadherin 在肝癌细胞株存在与在 C6 细胞中一致的分子机制，即 T-cadherin 分子通过诱导 P21CIP1/WAF1 表达致使肝癌细胞于细胞周期 G2 期阻滞。二、 在临床切除的肝癌标本中研究 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，在人肝癌中揭示 T-cadherin 基因失活与肝癌的恶性生物学特征及预后的关系。1.研究 50 例临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织中 T-cadherin 的表达，揭示T-cadherin 基因表达水平（失活）与肝癌恶性分化程度、肝内转移（包括合并门静脉癌栓和卫星灶形成）的关系。2.结合临床病案记录，选择在临床分期、病理类型及治疗方法上具有可比性的肝癌病例，分别选取肝癌切除术后半年内复发或肝外转移以及 2 年 内未复发或肝外转移的肝癌病例的石蜡标本各 20 例，研究 T-cadherin 基因的表达，揭示 T-cadherin 基因表达水平（失活）与肝癌复发和转移的关系。三、在肝癌细胞株和裸鼠肝癌种植模型上证实去甲基化药物 5-aza-2-deoxycytidine 是否能重新诱导 T-cadherin 表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其对肝癌的治疗价值和可能的毒副作用。3、拟采取的研究方案及可行性分析一、研究 T-cadherin（T-cad）在肝癌中的基因功能的技术路线1.构建 T-cad 表达载体 pcDNA3.T-cad第 9 页版本 1.009.485国家自然科学基金申请书以脂质体 lipofectin 为载体转染肝癌细胞系 HepG2 细胞以 G418 筛选表达 T-cad 分子的阳性克隆Western blot 鉴定转染后 T-cad 蛋白表达比较表达 T-cad 的阳性克隆与不表达 T-cad 的肝癌细胞的生物学特征:细胞增殖计数3克隆增殖试验细胞粘附试验细胞聚集试验2.在裸鼠肝癌模型上观察 T-cad 阳性克隆与不表达 T-cad 的肝癌细胞的生物学特征a.裸鼠皮下分别接种 107 T-cadherin（+）或（-）的肝癌细胞（各20 只）b.观察：肿瘤生长速度肿瘤转移发生的时间、累及积器官及频率裸鼠的生存期3.研究 T-cadherin 基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制a.流式细胞仪检测表达 T-cadherin 阳性和阴性的肝癌细胞的细胞周期变化b.Western blot 检测细胞周期调控蛋白 p53,p21,p27,cyclin D 的表达变化c.研究是否 T-cadherin 分子在肝癌中同样存在诱导 P21 CIP1/WAF1表达致使肝癌细胞于细胞周期 G2 期阻滞的分子机制。二、研究 T-cadherin 基因失活与临床肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系的技术路线1.收集临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织各 50 例第 10 页版本 1.009.485H标胸腺嘧啶摄取率测定国家自然科学基金申请书a. 检测 T-cadherin 表达： 定量 PCR；免疫组织化学；Western blotb.比较肝癌与癌周肝组织中 T-cadherin 的表达水平，研究 T-cadherin 缺失表达（基因失活）与人肝癌发生的关系。c. 比较不同病例肝癌中 T-cadherin 的表达水平，研究 T-cadherin 表达水平与肿瘤病理分级、肝内转移（包括合并门静脉癌栓和卫星灶形成）的关系。2.结合临床病案记录，选择临床分期相同、病理类型一致、单个肿瘤大小在 25cm之间、无肝内外转移、行根治性切除后采用同样的治疗方案的肝癌病例，分别选取肝癌切除术后半年内复发或转移以及 2 年内未复发或转移的肝癌石蜡标本各20 例a. 检测 T-cadherin 表达： 免疫组织化学b. 回顾研究 T-cadherin 表达水平与肿瘤复发和转移的关系三、研究去甲基化药物诱导 T-cadherin 表达及其治疗学意义的技术路线。1.研究表明 T-cadherin 在肝癌细胞株 HepG2, PLC/PRF/C, TONG 和 HA22TNGH 中缺失。采用 Herman 已报导的检测 T-cadherin 启动子甲基化和非甲基序列的引物，进一步证实T-cadherin 在上述肝癌细胞株中的启动子甲基化现象。扩增甲基化序列引物，上 游5-TCGCGGGGTTCGTTTTCGC-3，下游 5-GACGTTTTCATTCATACGCG-3，扩增非甲化序列引物，上游5-TTGTGGGGTTGTTTTGT-3，下游5-AACTTTTCATTCATACACACA-3。 采用 Western blot 进一步证实 T-cadherin 在上述存在的启动子甲基化肝癌细胞株中蛋白水平表达缺失。2. 选 择 T-cadherin 启 动 子 高 度 甲 基 化 的 细 胞 株 与 去 甲 基 化 药 物5-aza-2-deoxycytidine（2ug/ml）作用 6 天后，采用 Western blot 检测 T-cadherin 蛋白水平表达; 采用细胞增殖计数、3H 标胸腺嘧啶摄取率测定、克隆增殖试验、细胞粘附试验和细胞聚集试验检测 T-cadherin 表达前后肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的变化。3.将 T-cadherin 启动子高度甲基化的细胞株（细胞数 1x107）分别接种 60 只裸鼠后随机分成两组（每组 30 只），治疗组再分成五组（每组 6 只），每组分别按 0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug/克体重每日皮下注射 5-aza-2-deoxycytidine，共注射一周，对照组仅注射生理盐水，观察不同组裸鼠的肿瘤生长速度、肿瘤转移发生的时间、累及器官及频率及裸鼠的生存期。4、项目的特色及创新之处1近年已开始有 T-cadherin 分子在肝癌、乳腺癌、肺癌及结直肠癌中表达显著下第 11 页版本 1.009.485国家自然科学基金申请书降、缺失的报导，推测 T-cadherin 分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色。 申请人（黄志勇）最新研究首次证实 T-cadherin 在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并首次揭示其肿瘤抑制功能的分子机制（Huang Zhiyong 等，Molecular andCellular Biology 2003,23:566-578）。但目前尚无人对 T-cadherin 在肝癌中的基因功能及其分子机制进行研究。基于申请人前期世界领先的研究工作基础，该研究将进一步揭示 T-cadherin 分子在肝癌中的基因功能和其分子机制，具有世界先进性和独创性。2. Cadherin 分子，如 E-，N-cadherin 分子缺失或突变与多种肿瘤的发生及转移特征密切相关，但目前对 T-cadherin 基因失活与肝癌的侵犯及转移等生物学特征的关系目前尚无研究，该研究具有先进性和独创性。3.T-cadherin 基因启动子甲基化在肝癌中具有特异性,且 T-cadherin 基因启动子甲基化与 T-cadherin 基因失活密切相关。但对应用去甲基化药物诱导 T-cadherin 表达并研究其对肝癌的治疗学意义目前尚无研究。该研究具有创新性和实用性。4.该研究的独到之处在于揭示最新肿瘤抑制基因 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性生物学特征的关系以及去甲基化药物对肝癌的治疗作用，该研究对进一步揭示肝癌发生发展的分子机制、研究更有效的治疗药物具有重要的科学及临床意义。5、年度研究计划及预期研究成果研究计划及进度：2005.1-2005.12 在肝癌细胞株和裸鼠肝癌模型上研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能。证实是否 T-cadherin 抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征。揭示 T-cadherin 基因表达抑制肝癌细胞恶性生物学特征的分子机制。2006.1-2006.12 在临床切除的肝癌标本中研究 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，揭示 T-cadherin 的肿瘤抑制基因功能失活与临床肝癌的恶性生物学特征及预后的关系。2007.1-2007.12 在肝癌细胞株和裸鼠种植肝癌模型上研究去甲基化药物是否能重新诱导T-cadherin 表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其对肝癌的潜在的治疗价值治疗作用和可能的毒副作用。预期研究成果：1.在国际上有影响的刊物发表论文 3-4 篇，在国内权威期刊上发表论文 8-10 篇。第 12 页版本 1.009.485国家自然科学基金申请书2.预期科研成果 3 项：a.T-cadherin 基因在肝癌中的基因功能及其机制b.T-cadherin 基因失活与肝癌恶性生物学特征的关系c.利用去甲基化试剂诱导 T-cadherin 表达对肝癌的治疗学价值（二）研究基础与工作条件1、工作基础：申请人从事肿瘤发生的分子机制，肝癌的免疫及基因治疗研究多年，发表研究论文19 篇，其中 6 篇被 SCI 收录，影响因子多达 40。在美国华盛顿大学神经肿瘤及分子遗传研究室从事神经系统肿瘤发生的分子机制的研究工作近 4 年，主要从事脑胶质细胞瘤发生、发展的分子机制，利用基因芯片寻找与脑胶质细胞瘤发生发展相关的遗传改变，并利用已知的脑胶质细胞瘤的遗传改变，如 Ras 激活突变， NF1 基因缺失，cdk4 过表达，P53 及 Rb 缺失，并在动物模型上进一步验证上述遗传改变与脑胶质细胞瘤发生发展的关系。首次利用 GFAP 启动子成功地建立了脑胶质细胞特异性 CDK4 基因过表达的动物模型，并揭示了 CDK4 过表达与 P53 基因缺失对脑胶质细胞增殖的协同作用。该文发表于 Oncogene 2002, 21:1325-1334（影响因子 6.0）。该 CDK4 转基因鼠系正在申请美国专利。同时，探索研究新基因如 T-cadherin 和 GAP43 基因对脑胶质细胞瘤生长、转移等恶性生物学特征的关系，首次发现 T-cadherin 和 GAP43 是两个重要的参与脑胶质细胞瘤生长调控的基因，并揭示其调节机制。论文分别发表于 Molecular and Cellular Biology2003, 23:566-578（影响因子 8.8）和 Cancer Research 2003, 63:2933-2939（影响因子 8.3）。参加在美国和印度召开的国际会议 3 次，在研究基因功能与肿瘤恶性生物学特征的关系、肿瘤发生的分子机制及治疗研究领域积累了丰富的经验。在对 T-cadherin 基因的研究中，首次证明了细胞粘附分子 T-cadherin 是抑制脑胶质细胞瘤生长及转移等恶性生物学特征的重要肿瘤抑制基因，并揭示其分子机制 是T-cadherin 分子通过诱导 P21 CIP1/WAF1 表达致使肿瘤细胞于细胞周期 G2 期阻滞。该文发表于 Molecular and Cellular Biology 2003,23:566-578。这一研究发现为进一步研究T-cadherin 分子在肝癌中的作用、功能及临床意义奠定了坚实的基础。2 前期关于 T-cadherin 研究的基础工作：第 13 页版本 1.009.485国家自然科学基金申请书图 1. 胶质母细胞瘤 C6 细胞转染 T-cadherin 基因后细胞增殖受抑。A.Western blot 显 示 转 染 T-cadherin 基 因 后 成 熟 型（105kDa）和前体（130kDa）T-cadherin 分子在 C6细胞中的表达。而转染空载体 pcDNA3 的 C6 细胞不表达 T-cadherin。B.以同样摩尔数的 pcDNA3.T-cadherin 和 pcDNA3 转染 C6 细胞后 14 天，前者培养皿中形成的细胞克隆数显著低于后者。C.克隆计数显示二者有极显著统计学差异（P0.01）。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578图 2. 转染后过度表达 T-cadherin 分子的不同 C6 细胞克隆的增殖均显著受抑。A. Western blot 证实 T-cadherin 成熟型分子（105KDa）和前体分子（130KDa）在转染 C6 细胞后的 T3、T9、T13 克隆细胞中的表达。B.直接细胞计数显示在培养第 7 天，与转染空载体的 V2、V3 克隆相比，T3、T9、T13 克隆的细胞增殖显著受抑。且其增殖受抑的程度与 T-cadherin 的表达水平成正相关。C.与转染空载体的 C6 克隆 V2、V3 相比，过表达 T-cadherin的 C6 克隆细胞（T3、T9、T13）在软琼脂中形成的克隆数显著减少。*表示有极显著统计学差异。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578第 14 页版本 1.009.485国家自然科学基金申请书图 3. T-cadherin 在 C6 细胞中过表达增强细胞伸展性及粘附能力，降低细胞纤移能力。A.