生物催化在药物合成中的应用.doc

生物催化在手性药物合成中的应用摘 要 近年来生物催化在药物合成中的应用越来越广泛，这取决于科学工作者在实验室的潜心研究。本文综述了生物催化在药物合成中的应用，生物催化剂的优化以及生物催化的发展前景与展望。关键词 生物催化 手性药物 生物催化剂 发展方向生物催化(biocatalysis)也称生物转化(biotransformation，bioconversion)，指以外源性的天然或合成的有机化合物为底物，添加至处于活性状态的生物体系或酶系中，在适宜的条件下进行培养，使得底物与体系中的酶发生相互作用，从而产生结构改变，其实质是酶催化反应。生物催化反应具条件温和、高效及高选性（化学、区域及立体选择性）等特点，被认为是一种资源节约型、环境友好型技术。在过去的几十年中，生物催化技术已经发展成为工业合成大宗化学品、医药中间体、活性药物等物质的重要工具，并有望在医药、精细化工等领域取代传统化学合成途径而成为主要的合成手段。1 生物催化在药物合成中的应用1.1利用生物催化对外消旋化合物进行拆分采用生物催化方法对手性化合物的拆分主要是利用酶或微生物对外消旋化合物中的一种对映体进行选择性催化以达到拆分的目的。徐毅 徐毅，潘江，许建和环氧水解酶催化合成(R)一和(S)一普萘洛尔J石油化工，2004，33(SI)：950952等利用筛选的具有环氧水解酶活力的酵母菌冻干细胞催化拆分消旋的缩水甘油萘基醚合成S-普萘洛尔，筛选到的沙雷氏杆菌在水一有机溶剂两相系统中直接催化转化高浓度的手性环氧酯底物经简单处理即可获得光学纯度99的地尔硫卓手性前体；Sugai等 Sugai Takeshi，Ohta HiromichiLipase-mediated efficient preparation of both enantiomers of 2-acetoxytetraoosanoic acid，the inter-mediate for sphingolipid synthesisJTetra Lett，1991，32(48)：70637064用酯酶对合成昆虫信息素、-维生素E、D3及前列腺素似物的重要中间体叔- -苯氧酸酯进行促酯化反应，得到了2种不同的异构体；Solodenko等 Solodenko V A，Belik M Y，Galushko S V，et alEnzymatic preparation of both L-and D-enantiomers of phosphonic and phosphonous analogues of alanine using penicillin acylaseJTetra：Asymm，1993，4(9)：19651968以青霉素酰化酶将与天然氨基酸极相似的具磷一碳键的胺基-烷基-磷酸盐的苯醋的衍生物进行拆分，得到 了2个同时具有酶抑制剂及植物生长调节剂功能的异构体。1.2 不对称合成反应不对称合成反应是将化学合成的前体转化为结构复杂的手性醇、酮、醛、胺、酯、酰胺等衍生物，也可将含硫、磷、氮、卤素及金属的前体转化为手性化合物。在不对称合成中引入生物催化技术愈来愈受到重视，涉及氧化还原酶、合成酶、裂解酶、水解酶、羟化酶、环氧化酶、醛缩酶等，取得了许多成就，也展示了手性化合物制备的良好前景 Tan J H,Xu J HBiocatalysis in development of green pharmaceutical processesJCurtOpin Chem Biol，2009，13(1)：43-50。如以固定化大肠杆菌细胞转化延胡索酸生产一天冬氨酸已经是成熟技术，甾体类化合物的不对称合成也是较早的研究对象。如稳居2010年全球最畅销品牌药首位的立普妥，其化学制备方法要从手性池开始，制备出手性中间产物，再在严格条件下经过侧链添加、羟基保护和脱氢等多个步骤制得。而采用生物催化方法，用脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶来催化连续的醇醛缩合反应，利用氨基醛和乙醛反应形成氨基内酯，随后通过常规氧化、保护和酯化形成他汀侧链。这一生物催化反应可具有较高的产量(200 gLd)及较高收率(90一95)，最重要的是具有极好的立体控制效果，ee值和de值可分别达到98和97。最近有人用不同来源的乙醇脱氢酶分别对对乙烯苯乙酮进行不对称还原，同时使用NADPH辅酶循环系统，分别得到了(S)一和(尺)一对乙烯苯乙醇，这2种不同构型的异构体在苯乙烯存在下发生聚合，得到平均相对分子质量为50006000的多聚物，这种多聚物又可以在脂肪酶催化下和醋酸乙烯发生转移反应，在此过程中，多聚物中仅(R)一部位可以发生转移反应(如图1)，产生的新的多聚物是性能参数优良的新型材料。 ADH=乙醇脱氢酶；CALB=南极假丝酵母酯酶B图1 芳香酮的不对称还原反应及制备酶反应材料的光学活性单体2 生物催化剂的优化2.1定点突变定点突变指通过分析研究蛋白质的三维空间结构，弄清结构与功能之间的关系后，改变蛋白质分子中个别氨基酸残基，产生具有新性状的蛋白质。由于生物催化剂的本质是酶，因此通过定点突变可以改变它的作用机制、底物特异性、辅酶特异性、立体专一性以及稳定性 Bornscheuer U T，Pohl MCurrOpinChemBio1，200l，5(2)：137一143。已经成功地利用定点突变提高酶的热稳定性的例子有很多。Declerck等通过定点突变将淀粉酶肽链上的天(门)冬酰胺残基敲除，结果改造过的淀粉酶热稳定性大大提高。Pichia stipitis中的木糖醇脱氢酶(PsxDH)是木糖醇发酵生成乙醇的关键酶。Annalum等在PsxDH中引入一个锌结合环，然后再对锌结合环进行定点突变。结果发现，突变体比野生型的热变性温度高108，半衰期温度高208。关于酶或蛋白质的热稳定性机制还没有完全清楚。但最近一些研究表明，蛋白质对热的耐受性强可能与结构中脯氨酸、精氨酸、酪氨酸含量高，谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸含量低有关，此外还可能与非刚性残基、盐键和氢的存在状态有关。与热稳定性相比，通过定点突变来改变酶立体选择性的成功例子相对较少，因为突变酶的立体选择性很难预测，但也有少量报道。例如，苯丙二酸羧酶在自然情况下能够催化苯丙二酸脱羧生成光学纯的(R)-苯丙酸。Terao等 Terao Y，Ijima Y，Miyanoto K，et alJM01Catalysis B：Enzymatic，2007，45(1/2)：1520在苯丙二酸脱羧酶的74位甘氨酸区域(68-77)引入半胱氨酸和用弱酸性的丝氨酸取代188位的半胱氨酸。结果发现，有两种突变酶的立体选择性完全翻转，并且仍具有催化活性。2.2 定向进化随着酶催化研究的逐步深入，人们发现酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求。但由于很多蛋白质的三维空间结构，以及结构与功能之间的关系不是很清楚，所以不能应用定点突变进行改造。近年来发展的分子定向进化则不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制情况，直接在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，即可在较短时间内完成漫长的自然进化过程。目前，定向进化常用方法主要有易错PCR和DNA改组两种技术。易错PCR是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变，产生有利突变体。它是通过改变PCR的反应条件来进行的，如调整4种dNTP的浓度、增加M92+的浓度、加入Mn2+或使用低保真度Taq聚合酶等。易错PCR的关键是控制DNA的突变频率。如果DNA的突变频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；如果突变频率太低，野生型的背景太高，样品的多样性则较少。通过易错PCR来改变酶稳定性的例子很多。Stephens等 Stephens D E，Rumbold K，Permaul ,et a1JBiotechnol，2007,127(3)：348一354利用易错PCR对来自Thermomyce lanuginosus的内向-1，4木聚糖酶进行定向进化，结果发现在80下，野生型的酶在10min中内，失去90的活性，而突变酶在80下，60min仍具有7l的活性，且在70下，半衰期为215min。DNA改组是将一群密切相关的序列在DNase的作用下将随机酶切成小片段，这些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它们通过自身引导PCR交错延伸，并重新组装成全长的基因，又称有性PCR。由于DNA改组时DNA小片段交错延伸模板的不同，使合成的DNA片段包含了不同模板DNA的信息，这样亲本基因群中的突变就可以尽可能组合，导致更大的变异，并最终获取最佳突变组合的蛋白质或酶。例如，Fortin等运用易错PCR：饱和突变和DNA改组对加双氧酶(DoxG)进行定向进化，得到DoxG的变异体DoxGaMA2：，其专一性比野生型双加氧酶提高了770倍。当DNA改组用来重组一套与进化相关的基因时，被称为family shufling。Rosic等 Rosic N N，Huang W，Johnston W A，et a1Gene，2007，395(1/2)：4048利用DNA family shuming对细胞色素P450酶进行定向进化，结果增加了细胞色素P450酶的多样性。3结语