靶向聚合物纳米磁共振纳米探针的初步研究.docx

科研训练报告书项目名称：靶向聚合物纳米磁共振纳米探针的初步研究学生姓名： 张渤学号：2014211923专业班级：高分子14-2班指导教师：何涛2016年 6月 20 日靶向聚合物纳米磁共振纳米探针的初步研究摘要：当前，恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，如何攻克癌症顽疾成为一个亟待解决的问题。其中，阳离子聚合物由于显而易见的优势已经逐渐受到人们的密切关注，可望今后在肿瘤的早期诊断和治疗上发挥重大作用。本文的主要基于聚乙二醇-聚乙烯亚胺与超顺磁性氧化铁的前列腺癌靶向核磁共振显像纳米探针的研究。关键词：聚乙二醇-聚乙烯亚胺，磁共振成像基础，分子探针，纳米科技，癌症的早期诊断科研训练报告正文（附参考文献）一、研究现状及意义1.1磁共振成像基础20世纪40年代磁共振作为一种物理现象就应用于物理学、化学和医学领域。1946年美国斯坦福大学的Bloch等用感应法和哈佛大学的Purcell等用吸收法同时分别独立测得水和石蜡的核磁共振吸收。由于Purcell和Bloch在探索物质微观结构领域做出了重大贡献，1952年荣获诺贝尔物理学奖。在核磁共振成像领域，美国纽约州立大学Lauterbur于1973年在Nature杂志上首先发表一种叫“Zeugmatography”核磁共振成像方法的论文，紧接着在Mansfield又发表了“选择激发序列”的成像方法，从此核磁共振成像得到了空前的发展，如今已成为临床诊断的重要方法，使人们长期以来设法用无损伤的方法既能取得活体器官的详细诊断图像，又能监测活体器官和组织中的化学成分和化学反应的梦想得以实现。Lauterbur和Mansfield也在2003年荣获诺贝尔生理医学奖【1】。磁共振是物质原子核磁矩在外磁场的作用下能级发生分裂，并在外加射频磁场的能量条件下产生的能级跃迁的核物理现象。电子、质子、中子等都具有自旋和磁距的特性。质子和中子的数目是奇数或两者都是奇数时，例如1H、13C、19F、23Na、31P等，这些原子的原子核就具有自旋和磁距。H是人体内数量最多的元素，且原子核只含一个质子，是人体内最活跃、最易受外界磁场影响的原子核，被磁化的氢原子数越多，散发的能量越大，磁共振信号就越强。故目前设计的磁共振成像系统大多数是采用氢质子成像的。在常态状况，各磁距是相互抵消的，当有一外加磁场存在时，体内质子或中子的自旋被磁化(magnetization)，使原来的自旋轴依据外磁场的方向旋转，这种旋转动作称进动(precession)，或顺外磁场方向处于低能态，或逆外磁场方向处于高能态。在此情况下，用一个频率与进动频率相同的射频脉冲(radiofrequencepulse，RF)激发欲检查的原子核，将引起共振，即磁共振。当RF终止时，原子核将其所吸收的能量以电磁波的形式(射频信号)向外释放，直至完全恢复到沿顺外加静电磁场方向排列的平衡状态，这个过程为弛豫(relaxation)。所需的时间称弛豫时间(relaxationtime)，一般都很短，以毫秒(ms)计。弛豫时间分两种：T1弛豫时间和T2弛豫时问。T1或纵向弛豫时间，其定义是平行于主磁场Z轴的磁化矢量当其恢复到最后最大量的63时所需的时间。因其能量的交换是由自旋质子传递给周围环境(晶格)，故也称为自旋-晶格弛豫时间。T2或横向弛豫时间：是指在xy轴上的磁化矢量由最初最大值逐渐衰减到37时所需的时间。此期间的能量交换是自旋质子传递给其周围的自旋质子，故又称为自旋-自旋弛豫时间。T1和T2具有特异性，每种正常和病变组织的T1、T2值均不相同，1H的T1、T2值可反映其周围的化学或磁环境。在MR成像中，质子密度(单位体积内1H的数量，用Pd表示)也是一种成像参数，但不如T1、T2重要。在实际应用中，往往要通过调整重复激发时间(TR)和回波时间(TE)来突出T1、T2和Pd成分的成像，分别称T1加权成像(T1WI)、T2加权成像(T2WI)和Pd加权成像(PdWI)。由于射频脉冲之形式、时间、序列的变化和对所接收的信号分析处理方式不同，因此同一标本MRI可获得许多不同的结果，即不同密度分布。且各序列对结构显示的侧重面和清晰度也各异，更易从不同角度了解病变过程和定性【2】。1.2分子探针分子探针指对某特定生物分子（如蛋白质）具有特异性靶向、并能进行体内或体外示踪的标记物分子，这些分子能够在体或离体反映其靶生物分子的量和功能【3】。MR分子成像的原理是借助分子探针，通过靶向结合或酶激活的原理及适当策略放大信号，用高分辨力的成像系统检测相应的信号改变，间接反映分子或基因的信息。分子成像的关键在于正确选择靶位。超顺磁性氧化铁纳米粒子是一种高顺磁性、高特异性及高生物相容性的分子探针，在血管成像、鉴别良恶性淋巴结、诊断早期肿瘤等方面有着良好应用前景【4】。1.3 研究意义随着肿瘤发病率的不断提高，肿瘤给人类带来的痛苦越来越大。早期发现肿瘤较困难，待确诊后，一些原本有效的治疗方法已不能完全发挥作用，因此对恶性肿瘤的早期诊断以及治疗已经成为目前临床急待解决的问题。“诊断及治疗纳米药物”可以同时实现对肿瘤的靶向诊断及药物输送，进而实现癌症的同步诊断和治疗。人类健康是一个永恒的课题，随着人类经济社会的发展，健康问题越来越受到人们的重视。当前，癌症是对人类健康危害最严重的疾病之一，发病率持续上升，造成严重的社会和经济负担。由于缺乏高灵敏度诊断及低毒副作用治疗方法，癌症的早期诊断和治疗仍然是当今医学的难题之一【5】。纳米科技的发展给癌症治疗提供了新手段，纳米载体将抗癌药物靶向释放到病灶部位，增加病灶处局部药物浓度，不仅能显著提高疗效，且可降低抗癌药物对正常组织的伤害【6-11】。而纳米科学、高分子科学和分子影像学的有机结合，发展出了“诊断及治疗纳米药物”(theranostic nanomedicine)，给癌症的诊断和治疗开辟了一片新天地12-17。其中，MRI “诊断及治疗纳米药物”可以克服MRI造影剂及抗癌药物靶向性、稳定性差等缺点，提高疏水性药物的水溶性，延长药物和MRI造影剂在血液中的循环时间，同时对肿瘤具有靶向作用，降低对正常细胞和组织的毒副作用5,18,19。二、项目方案 2.1 立项依据：恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，如何攻克癌症成为一个亟待解决的问题。目前，MRI对由于其显而易见的优点被广泛用于肿瘤的早期诊断，但是其半衰期过短及缺乏足够灵敏度限制了其应用范围，因此如何实现用高灵敏度磁底物剂对肿瘤部位的靶向性传输引起了人们的广泛兴趣。本文从肿瘤的早期诊断和基因治疗着手合成了聚乙二醇-聚乙烯亚胺，通过配体交换的方法包裹超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(SPIO)，再通过功能化的聚乙二醇与活化的前列腺干细胞抗原(PSCA)单克隆单链抗体结合，得到前列腺癌细胞靶向核磁共振显像纳米探针。研究表明，这种抗体连接的负载超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺能够显著提高对前列腺癌细胞的特异性输送效率，从而显著地降低前列腺癌细胞的核磁共振成像(MRI)T2信号强度，增强对前列腺癌的识别效率。2.2创新点：通过在聚合物表面连接特异性抗体并在内部负载超顺磁性纳米粒子(SPIO)，得到了一种潜在的前列腺癌MRI早期诊断新型纳米探针。2.3实验方案及实验结果表征2.3.1实验材料单甲基醚聚乙二醇(mPEGOH 2kDa),支化聚乙烯亚胺(hy-PEI 25 kDa), 2-巯基乙胺(97), N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)(98) ,N-甲氧基羰基马来酰亚胺 (97) ,N,N-羰基二咪唑(CDI),丁二酸酐,乙二胺四乙酸(EDTA),二环己基碳酰亚胺(DCC)(98),四氢呋喃(THE)和三氯甲烷(CHCl3)预先用CaH2干燥一周备用；预先配置pH=7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)备用；超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(SPIO)按Sun报道的方法合成【28】,平均粒径为6nm；-羟基-w-氨基聚乙二醇按Tromsdorf报道的方法合成【29】。2.3.1仪器产物的化学结构通过Varian INOVA 500NB超导核磁共振仪进行分析鉴定；聚合物SPIO含量用Z-2000型偏振塞曼原子吸收分光光度计测量；粒径和电位采用Brooken Haven ZetaPlus电位粒径仪进行测定，入射激光波长=532 nm，入射角90度，温度为25；LSM 510 META型激光共聚集显微镜；Carl ZeissAviox-I型倒置荧光显微镜；Signa EXCITE II Twinspeed超导型核磁共振扫描仪；Tecan Infinite F200 Multimode plate reader Tecan多功能酶标仪。2.3.2 实验方案2.3.2.1聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺(mPEG-g-PEI)的合成称取4.0 g单甲基醚聚乙二醇(Mn=2 kDa)于干燥两121瓶中，60真空干燥5h，冷却后Ar保护下加入30 mL已干燥THF中充分溶解。称取CDI 2.27 g置于另一干燥两口瓶中，加保护下将溶有mPEG-OH的THF溶液缓慢滴加到两口瓶中，室温下继续搅拌反应12 h。加入0.216 mL水使过量的CDI失活，反应进行0.5 h。用大量无水乙醚沉淀2次，过滤后干燥得白色粉末状固体。再称取3.O g支化聚乙烯亚胺(Mn=25 kDa)和2.4 g上述白色粉末分别溶于10mL CHCl3，并将溶有白色粉末的CHCl3溶液加入到hy-PEG的CHCl3溶液中，搅拌反应过夜。用大量无水乙醚沉淀3次，干燥得白色粉末状固体，产率为70。反应路线见下图。2.3.2.2负载SPIO的聚乙二醇一聚乙烯亚胺的制备参考Tromsdorf等报道的方法【29】制备mPEG-g-PEI-SPIO。称取450mg mPEG一g一PEI和30 mg SPIO(6nm)共溶解予5 mL CHCl3中，室温下搅拌过夜并用氩气吹干到约2 mL，向其中加入约10 mL正己烷，震荡3小时并吸层清液，重复上述操作3次。将溶剂挥发干，向其加入约5 mL双蒸水，超声搅拌30分钟使其充分溶解，以转速12000 r/min离心1.5小时，取清液用220 am针头过滤器过滤样品，在4下放置备用。采用原子吸收法测定mPEG-g-PEI-SPIO中SPIO的含量。将已知重量的PEG-g-PEI-SPIO分散到l M HCI溶液中，使SPIO分解为铁离子并溶解在溶液中。根据已经建立的标准曲线，测定248.3 nm处的吸收，计算出铁含量。用氧化铁的质量除以胶束的总质量，得到SPIO的负载率。2.3.2.3 -羧基-马来酰亚胺聚乙二醇报合成参考Shen等报道的办法合成mal-PEG-OH【30】，首先将3.0g NH2-PEGOH(Mn=3.6 kDa)溶解于15mL NaHC03饱和溶液，施过冰盐浴使其冷却至0，向兑中加入O.42 gN-甲氧基羰基马来酰亚胺并搅拌lO分钟，向其中加入30mL蒸馏水并继续搅拌45分钟，用0.5M的硫酸溶液调节pH到3.0。以二氯甲烷萃取三次并用硫酸钠干燥，过滤并将滤液加入到大量冷乙醚中，过滤干燥得白色粉末状固体。参考Shuai等报道的方法台成mal-PEG-COOHl2【31】，将300 mg上述白色粉末加入三口瓶中，室温下真空干燥5h，加入20 mLCHCl3，待其溶解后再加入50mg丁二酸酐，70搅拌引流反应48小时，减压除掉部分CHCl3，沉淀至大量无水乙醚中，过滤收集粗产物，再用少量CHCl3溶解粗产物，沉淀至大量无水己醚中，过滤干燥得白色粉末状产物。合成路线见下图。2.3.2.4单链单克隆抗体-聚乙二醇-聚乙烯亚胺负载SPIO合成按文献【32】方法先准备好有游离巯基的单克隆单链抗体。50L的AbpscA加EDTA溶液(10 pL O.5 M)；60 mg 2-巯基乙胺溶解在O.5 mL PBS(含10L 0.5 M)中，4预冷孵育15 min，然后加入到上述含AbPSCA的溶液中。在37孵育90min。用脱盐柱(PD-10 Desalting Columns，GE Healthcare，MWCO=5000)除掉过量的2-巯基乙胺，把打开了双链的抗体立即与含有malPEG-COOH(10g)的PBS(500L含10 L 0.5 M EDTA，预冷)溶液混和，在4放置过夜。再用脱盐柱(MWCO=5000)脱去多余mal-PEG-COOH，产物中加入EDC和NHS各5g孵育20 min。把上述产出与lOg mPEGgPEISPIO溶液混和，4放置过夜。为了检验抗体是否成功的连接上mPEG-g-PEI-SPIO，按操作方法，用羊抗鼠lgG-FITC二抗与mPEG-g-PEI-SPIO抗体复合物孵育，然后离心复合物溶液，弃上清液，用PBS重悬，与PC3M细胞37孵育20分钟，在荧光显微镜下观察荧光情况。2.4 实验预期成果用于疾病早期诊断的聚合物纳米探针是目前非常热门的研究领域，聚合物纳米探针在肿瘤组织中可获得独特的被动性的靶向聚集效应。此外，利用肿瘤细胞的特定受体，在纳米粒子中引入相应的配体以获得受体介导的细胞内吞作用，己经证明是能增强纳米粒子的肿瘤细胞靶向性和胞吞作用，避免正常细胞胞吞的有效途径。靶向肿瘤纳米诊断探针研究是疾病早期诊断研究中的热点领域，在诸多肿瘤胞主动配体靶向技术中，抗体靶向性一致受到极大的关注，主要是因为抗体和原性受体结合具有高特异性、高选择性、亲和力强及生物效应明显的特点。抗体是由相同性质的双链构成，分解成单链不仅可减小其体积和重量，同时仍然保留原来的抗体特征，更使经其修饰过的纳米粒子易于透过胞吞作用进入细胞内。PSCA是前列腺瘸上高表达的膜抗原蛋白，与相应的单克隆抗体特异性结合，是前列腺癌一种潜在的靶离诊断与治疗的靶点膜蛋自。利用单克隆单链抗体scAbpscA与PSCA的特异性结合原理，产生主动靶向作用，有望开发出一种新型高效的前列腺癌早期诊断的MRI纳米探针。三、 年度计划2016.072016.08查阅相关文献资料，设计具体实验方案，撰写开题报告2016.08开题报告2016.082016.12实验研究、数据统计、处理与分析2017.012017.03填写结题表，撰写研究论文和总结报告2017.05课题结题答辩四、 参考文献1熊本欣，李立本，核磁共振成像原理北京：科学出版社2沈鼎烈，王学峰，临床癫癎学（第二版）上海：科学技术出版社3申宝忠分子影像学北京：人民卫生出版社，2010:61-63.4刘国华超微超顺磁性氧化铁纳米粒及其在肿瘤磁共振成像中的应用医学综述，2010,16(16)：249424975 C.Khemtong; C.W.Kessinger; J.M.Gao.2009.Polymeric nanomedicine for cancer MR imaging and drug delivery J. Chem Commun, 3497-3510.6 M. Ferrari. 2005. Cancer nanotechnology: opportunities and challenges J.Nat Rev Cancer,5:161-171.7 D.Peer; J.M. Karp; S.Hong,et al.2007.Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy J.Nat Nanotechnol,2:751-760.8 F.X.Gu;R.Karnik;A.Z.Wang,et al.2007.Targeted nanoparticles for cancer therapy J.Nano Today,2:14-21.9 T.Lammers; W.E.Hennink; G.St.orm.2008. Tumour-targeted nanomedicines: principles andpractice J. Brit J Cancer, 99:392-397.10 J. D. Heidel; M. E. Davis. 2011. Clinical developments in nanotechnology for cancer therapy J. Pharm Res-Dordr, 28:187-199.11 C. Oerlemans; W. Bult; M. Bos, et al. 2010. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release J. Pharm Res-Dordr, 27:2569-2589.12 B. Sumer; J. M. Gao. 2008. Theranostic nanomedicine for cancer J. Nanomedicine-Uk,3:137-140.13 K. Park; S. Lee; E. Kang, et al. 2009. New generation of multifunctional nanoparticles for cancer imaging and therapy J. 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