高中生物 专题2课题1微生物的实验室培养课件2 新人教版选修1.ppt

课题1微生物的实验室培养 一 培养基 人们按照微生物对营养物质的不同需求 配置出供其生长繁殖的营养基质称培养基 按成分不同划分 天然培养基 合成培养基 化学成分不恒定的天然有机物 牛肉膏蛋白胨培养基 麦芽汁培养基 用于工业生产 化学成分完全了解的物质配制而成的培养基 高氏1号培养基 查氏培养基 用于分类和鉴定 1 培养基的类型及其应用 按物理状态不同划分 固体培养基 液体培养基 在液体培养基中加入一定量凝固剂 使其成为固体状态 琼脂含量一般为1 5 2 0 琼脂含量一般为0 2 0 7 不加任何凝固剂 半固体培养基 固体培养基常用来进行微生物的分离 鉴定 活菌计数及菌种保藏 观察微生物的运动特征 分类鉴定及噬菌体效价滴定 大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究 按用途不同划分 基础培养基 鉴别培养基 含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基 用于鉴别不同类型微生物的培养基 选择培养基 微生物产生某种代谢产物 与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应 产生明显的特征变化 在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质 抑制不需要的微生物的生长 有利于所需微生物的生长 选择培养基 加入青霉素的培养基 分离酵母菌 霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基 分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基 分离杂交瘤细胞 例 以下是单克隆抗体制备流程示意图 根据培养基的 分类 图中hat培养基属于 培养基 选择 用途 2 培养基的化学成分 不管哪种培养基 一般都含有水 碳源 和氮源 无机盐等营养物质 另外还需要满足微生物生长对ph 特殊营养物质 例如 生长因子 即细菌生长必需 而自身不能合成的化合物 如维生素 某些氨基酸 嘌呤 嘧啶 以及氧气 二氧化碳 渗透压等的要求 不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 碳源 有机碳 无机碳 异养微生物 自养微生物 氮源 有机氮 无机氮 nh3铵盐硝酸盐n2 蛋白质核酸氨基酸尿素 注 对于异养微生物 含c n的化合物既为碳源 也是氮源 微生物生长不可缺少的微量有机物如 维生素 氨基酸 碱基等 生长因子 牛肉膏当中含有肌酸 肌酸酐 多肽类 氨基酸类 核苷酸类 有机酸类 矿物质类及维生素类 的水溶性物质 牛肉膏为微生物提供碳源 氮源 能源 磷酸盐和维生素 蛋白胨主要提供氮源和维生素 氮源 能源 生长因子 碳源 能源 生长因子 培养基配置原则 目的明确 营养协调 理化条件适宜 经济节约 根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基 培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累 如 ph 二 无菌技术 1 对实验操作的空间 操作者的衣着和手 进行清洁和消毒 2 将用于微生物培养的器皿 接种用具和培养基等器具进行灭菌 3 为避免周围环境中微生物的污染 实验操作应在酒精灯火焰附近进行 4 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触 2010广州调研 下列实验方法及其结果合理的是a 稀释的鸡蛋清溶液与蛋白酶混合后用双缩脲试剂检测会发生紫色反应b 酒精溶液与重铬酸钾溶液混合后在沸水浴条件下才会出现灰绿色c 在植物组织培养中 可用酒精对外植体进行灭菌d 用二苯胺试剂鉴定dna时 在沸水浴条件下溶液呈蓝色 双选 1 常用消毒和灭菌方法 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂消毒法 紫外线消毒法 灼烧灭菌 100 5 6min 部分细胞和芽孢 75 30min 80 15min 牛奶 干热灭菌 高压蒸汽灭菌 灼烧灭菌 干热灭菌箱 高压蒸汽灭菌锅 煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂 70 酒精等 紫外线 针对不耐高温的液体 接种室 超净工作台 能耐高温的 需要保持干燥的物品 灼烧法干热灭菌高压蒸汽灭菌 接种工具 接种环等 吸管 实验操作者的双手 培养皿等玻璃器皿 培养基 1 消毒方法 2 灭菌方法 干热灭菌 计算 称量 溶化 灭菌 倒平板 三 实验操作 1 制备培养基 例2 进行细菌接种培养实验时 以下哪个操作步骤是非必要的 a 双手带上胶手套b 接种前后都灼烧接种环c 接种前后都灼烧菌种试管口和待接种斜面试管口d 要丢弃带菌培养基前 进行高压蒸汽灭菌或加热灭菌 1 培养基灭菌后 需要冷却到50 左右时 才能用来倒平板 你用什么办法来估计培养基的温度 刚刚不烫手时 2 为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰 灼烧灭菌 防止瓶口的微生物的污染 有关问题 防止皿盖上的水珠落入培养基 造成污染 3 为什么将平板倒置 2 纯化大肠杆菌 平板划线法 稀释涂布平板法 平板分离 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 就是菌落 根霉曲霉青霉 将接种环放在火焰上灼烧 直到接种环 在 旁冷却接种环 并打开棉塞 将试管口通过火焰 将已 的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液 左手将皿盖打开一条缝隙 右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内 划 条平行线 盖上皿盖 注意不要划破培养基 将试管通过火焰 并塞上棉塞 火焰 冷却 三至五 灼烧接种环 待其冷却后 从第一区域划线的 开始往第二区域内划线 重复以上操作 在三 四 五区域内划线 注意不要将最后一区的划线与第一区相连 末端 烧红 将平板 放入培养箱中培养 倒置 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后 接种环上残留的菌种 使下一次划线时 接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端 从而通过划线次数的增加 使每次划线时菌种的数目逐渐减少 以便得到菌落 划线结束后灼烧接种环 能及时杀死接种环上残留的菌种 避免细菌污染环境和感染操作者 避免接种环温度太高 杀死菌种 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少 将菌液进行一系列的梯度稀释 然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面 进行培养 在稀释度足够高的菌液里 聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞 从而能在培养基表面形成单个的菌落 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 取少量稀释液滴加到培养基表面 灼烧 待酒精燃尽后冷却8 10s 涂布 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面 涂布时可转动培养皿 使涂布均匀 3 菌种培养 培养基倒置放入37 的恒温箱中 4 实验结果观察 5 菌株的保存方法 固体斜面培养基 甘油管藏 搁置斜面 课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一 课题背景 1 尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥 尿素不能直接被农作物吸收 土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用 2 细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 3 常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌 小球菌 假单胞杆菌 克氏杆菌 棒状杆菌 梭状芽孢杆菌 某些真菌和放线菌也能分解尿素 4 课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一 研究思路 筛选菌株 统计菌落数目 设置对照 1 实例 启示 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求 到相应的环境中去寻找 原因 因为热泉温度70 800c 淘汰了绝大多数微生物只有taq细菌被筛选出来 dna多聚酶链式反应是一种在体外将少量dna大量复制的技术 此项技术要求使用耐高温 930c 的dna聚合酶 要分离一种微生物 必须根据该微生物的特点 包括营养 生理 生长条件等 方法 抑制大多数微生物不能生长 造成有利于该菌生长的环境 2 实验室中微生物的筛选原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件 包括营养 温度 ph等 同时抑制或阻止其他微生物生长 3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基 从物理性质看此培养基属于哪类 固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源 氮源 碳源 葡萄糖 尿素氮源 尿素 培养基的氮源为尿素 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 以尿素作为氮源 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素 缺乏氮源而不能生长发育繁殖 而受到抑制 所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物 4 培养基选择分解尿素的微生物的原理 1 显微镜直接计数 利用血球计数板 在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量 统计菌落数目 不能区分死菌与活菌 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度 个体小的细菌在显微镜下难以观察 缺点 2 间接计数法 活菌计数法 原理 在稀释度足够高时 微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的 即一个菌落代表原先的一个单细胞 常用方法 稀释涂布平板法 每克样品中的菌落数 c v m其中 c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 v代表涂布平板时所用的稀释液的体积 ml m代表稀释倍数 注意事项 为了保证结果准确 一般选择菌落数在30 300的平板上进行计数 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中 经涂布 培养计算出菌落平均数 统计的菌落往往比活菌的实际数目低 对位训练1 分离土壤中分解尿素的细菌 对培养基的要求是 加尿素 不加尿素 加琼脂 不加琼脂 加葡萄糖 不加葡萄糖 加硝酸盐 不加硝酸盐a b c d c 注意事项 为了保证结果准确 一般选择菌落数在30 300的平板上进行计数 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中 经涂布 培养计算出菌落平均数 统计的菌落往往比活菌的实际数目低 涂布平板法所选择的稀释度很重要 一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好 设置对照 实例 在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时 a同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落 但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落 分析其原因 原因 土样不同 培养基污染或操作失误 小结 通过这个事例可以看出 实验结果要有说服力 对照的设置是必不可少的 方案一 由其他同学用与a同学相同土样进行实验 方案二 将a同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养 作为空白对照 以证明培养基是否受到污染 结果预测 如果结果与a同学一致 则证明a无误 如果结果不同 则证明a同学存在操作失误或培养基的配制有问题 实验组 选择培养基对照组 牛肉膏蛋白胨培养基接种后培养 观察两种培养基上菌落数目 进行对比得出结论 2 判断选择培养基是否具有选择作用 1 判断培养基是否被杂菌污染 实验组 接种的培养基对照组 未接种的培养基 空白对照 在相同条件下培养 观察未接种的培养基上是否有菌落 二 实验的具体操作 土壤取样选肥沃 湿润的土壤 铲去表层土3cm左右 再取样 将样品装入信封中 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 制备培养基 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基 称取土壤10g加入90ml无菌水 依次配置一系列梯度的土壤稀释液 三 样品的稀释 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量 选用的稀释范围相同吗 原因 土壤中各类微生物的数量 单位 株 kg 是不同的 例如在干旱土壤中的上层样本中 好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万 放线菌数约为477万 霉菌数约为23 1万 结论 为获得不同类型的微生物 就需要按不同的稀释度进行分离 同时还应当有针对性地提供选择培养的条件 取样涂布 每个稀释度下涂布3个平板 并对培养皿 试管进行标记 微生物的培养与观察 2 观察菌落特征 1 培养不同微生物往往需要不同培养温度 微生物的培养与观察 六 菌落计数 选取某稀释度下有2 3个平板中菌落数在30 300的平板计数 求菌落数的平均值 再根据公式计算菌种数 三 结果分析与评价1 通过对照实验 若培养物有杂菌污染 菌落数偏高 若培养物混入其他氮源 则菌落形态多样 菌落数偏高 难以选择出分解尿素的微生物 2 提示 选择每个平板上长有30 300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适 同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊 如相差较大 表示实验不精确 四 操作提示 无菌操作 做好标记 规划时间 五 课外延伸在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 培养某种细菌后 如果ph升高 指示剂将变红 说明该细菌能够分解尿素 测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后 将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养 大肠杆菌菌落呈现黑色 通过记述得出水样中大肠杆菌的数量 大肠杆菌呈黑色中心 有或无金属光泽 大肠杆菌在伊红美蓝琼脂 emb 上典型特征 本课题知识小结 1 使用选择培养基的目的是 a 培养细菌b 培养真菌c 使需要的微生物大量繁殖d 表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2 能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是 a co2和n2b 葡萄糖和nh3c co2和尿素d 葡萄糖和尿素 实践训练 c d 3 下列说法不正确的是 a 科学家从70 80度热泉中分离到耐高温的taqdna聚合酶b 统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为m1 m2 m3 m4 m5 以m3作为该样品菌落数的估计值c 设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响 提高实验结果的可信度d 同其他生物环境相比 土壤中的微生物数量最大 种类最多 4 为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌 常在培养基中加入 a 较多的氮源物质b 较多的碳源物质c 青霉素类药物d 高浓度食盐 b c 课题3分解纤维素的微生物的分离 纤维素与纤维素酶 1 纤维素 纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物 是含量最丰富的多糖类物质 植物的根 茎 叶等器官都含有大量的纤维素 其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物 一 基础知识 土壤中某些微生物能够产生纤维素酶 把纤维素分解为葡萄糖 后再利用 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质 植物每年产生的纤维素超过70亿吨 其中40 60 能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用 不会大量积累 在草食性动物等的消化道内 也共生有分解纤维素的微生物 其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素 而人没有分解纤维素的能力 人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精 用纤维素酶处理服装面料等 2 纤维素酶纤维素酶是一种复合酶 一般认为它至少包括三种组分 即c1酶 外切酶 cx酶 内切酶 和葡萄糖苷酶 前两种酶使纤维素分解成纤维二糖 第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖 取二支20ml的试管 实验 纤维素酶分解纤维素的实验 各加入一张滤纸条 各加入ph4 8 物质量为0 1mol l的醋酸 醋酸钠缓冲液11ml和10ml 甲乙 在乙试管中加入1ml纤维素酶 两支试管固定在锥形瓶中 放在140r min的摇床上振荡1h 结果 乙试管的滤纸条消失 讨论 乙试管的滤纸条为什么会消失 甲试管的作用是什么 纤维素分解细菌的筛选 1 方法 刚果红染色法 2 原理 刚果红可以与纤维素形成红色复合物 当纤维素被纤维素酶分解后 红色复合物无法形成 出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌 3 优点 该方法可以通过颜色反应直接筛选 二 实验设计与操作 实验设计 旁栏思考题 本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同 提示 本实验流程与课题2的流程的区别如下 课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上 直接分离得到菌落 本课题通过选择培养 使纤维素分解菌得到增殖后 再将菌液涂布在鉴别培养基上 其他步骤基本一致 操作过程 1 土壤取样 采集土样时 应选择富含纤维素的环境 若找不到合适环境 可将滤纸埋在土壤中一个月左右 也会有能分解纤维素的微生物生长 旁栏思考题 为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌 答 生物适应一定环境 环境对生物具有选择作用 只有在纤维素含量丰富的环境中纤维素分解菌的含量才会高于其它普通环境 从而提高获得目的微生物的几率 旁栏思考题 将滤纸埋在土壤中有什么作用 你认为滤纸应该埋进土壤多深 答 人工设置适宜环境 使纤维素分解菌相对聚集 将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中 2 选择培养 选择培养的目的 增加纤维素分解菌的浓度 以确保能够从样品中分离到所需要的微生物 制备选择培养基 配方是液体培养基还是固体培养基 为什么 答 是液体培养基 原因是配方中无凝固剂 这个培养基对微生物是否具有选择作用 如果具有 是如何进行选择的 答 有选择作用 本配方中的碳源是纤维素 所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖 你能否设计一个对照实验 说明选择培养基的作用答 用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照 选择培养 将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中 将锥形瓶固定在摇床上 在一定温度下震荡培养1 2天 直至培养液变浑浊 也可重复选择培养 旁栏思考题 为什么选择培养能够 浓缩 所需的微生物 提示 在选择培养的条件下 可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖 而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制 因此可以起到 浓缩 的作用 按照课题1的稀释操作方法 将选择培养后的培养基进行等比稀释101 107倍 3 梯度稀释 4 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 1 制备鉴别培养基 2