改良线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的经验总结.doc

改良线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的经验总结【中图分类号】R722.t2 【文献标识码】B 【文章编号】2095-6851（2017）01-0-01脑卒中是一种急性脑血管疾病，而缺血性脑卒中的发病率高于出血性脑卒中，占脑卒中的60%一70%。由于临床研究限制，为弄清缺血性卒中的演变过程和干预措施疗效观察，探寻缺血性卒中的形成机制和防治策略，建立最接近人类脑梗死的理想动物模型尤其重要。大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery， occlusion，MCAO）模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型1。在脑缺血动物模型制作的研究中，用大鼠建立MCAO脑缺血的动物模型最为合适。制备MCAO模型的方法有很多种，包括光化学法、三氯化铁法、线栓法、自体血栓法、电流损伤法、自发性MCAO法等2。由于线栓法具有不开颅、效果肯定、易操作等优点，是常用的模型制备方法3-4。但该方法仍存在技术要求高、模型差异性大、动物死亡率高等缺陷。因此，如何建立稳定、可靠、重复性高的MCAO动物模型成为目前函待解决的问题5。造模过程中笔者发现，一些微小的操作技巧也许就决定着实验最终的结果，谨以自身经验告之，希望让该科研课题的实验工作者有所收获。下面将主要从术前准备、术中操作及术后护理三方面进行详细讲述。1.术前准备1.1 实验大鼠的选择有学者认为大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的成功与合理选择实验动物有关6-8，首先是性别，实验应选用雄性SD大鼠，有研究表明，雌激素水平的变化与缺血性脑血管病的发生和发展有一定的关系。雌激素可减轻脑缺血的损伤，具有神经保护作用，包括增加脑血流量，阻滞兴奋性神经毒性损伤，舒张血管等作用9。其次是体重，大鼠体重的选择十分重要，它决定着大鼠血管直径的大小，在适应性喂养约1周时间后，根据制作的线栓头端的直径大小，来大致估算大鼠血管直径的范围，最后选择相应体重的大鼠进行实验。若体重过轻，线栓直径相对较大，易损伤血管；反之，则会因堵不住血管而出现持续性出血，造模失败。我们实验选用的线栓头端直径约0.36mm，大鼠体重250-280g，通过试验发现，在进食情况下，体重达280-290g的大鼠禁食不禁水12小时后，体重若维持在260-270g范围内，血管直径状况最适宜。1.2 实验材料准备在实验材料方面，除了药物，动脉夹、显微镊及结扎线的选择直接决定着造模的操作时间和成效。首先，动脉夹最好选用内侧有防滑齿的，防止脱落；动脉夹不宜过大，影响操作。其次最好配备显微镊，可用于分离血管及血管外膜；最后在结扎线的选择上，最好购买两种结扎线，粗线用来结扎大血管如颈总，不易损伤血管，在解线时更方便，细线用来结扎颈外断端及线栓口，这样线栓更好转弯，扎线的松紧更好掌握。2.术中操作2.1 麻醉选择适宜体重的大鼠，术前禁食不禁水12h，取出大鼠，用10%水合氯醛进行腹腔麻醉，计量按照3.5mL/kg，腹腔麻醉时注意角度及进针深度，避免注射到皮下。麻醉后5-10分钟，以指掐大鼠尾巴没有挣扎为准。2.2 分离血管将大鼠取仰卧位固定于鼠板上，头端朝术者，持无齿镊牵拉大鼠舌前部到一侧口角处，剃除颈部毛发，碘伏、酒精多次消毒颈部。以正中线行纵向切口，切口不宜过于靠近下颌，长度约1.5cm，用弯镊沿切口行钝性剥离，剥离皮下筋膜、肌肉及甲状腺，用拉钩将皮肤及肌肉拉开，充分暴露。尽量将气管两侧的组织分离干净，暴露颈总，沿气管右侧（笔者实验为右侧）进行血管分离，并仔细将颈总动脉上附着的筋膜全部分离，用弯镊从血管下面向两侧分离，直到看到颈内动脉和颈外动脉的分叉，切记小心与颈总伴行的迷走神经，由于个体差异，有些大鼠的迷走神经会横跨颈总后再向下行，要注意尽量少的刺激迷走神经，利用筋膜将其分离开。2.3 结扎利用拉钩充分暴露CCA、ICA、ECA，注意分清ICA和ECA，大鼠的颈外和颈内的分布与人类有所差异，近似于上下分布，颈外在上偏内，颈内在下偏外。用手术线分别穿过CCA、ICA、ECA做备用，在CCA尽量靠近心脏的方向用粗线结扎，活结，充分剥离ECA，在ECA靠近头端处打死结，靠近分叉处放置一细结扎线备用。用微动脉夹尽量远离分叉口夹闭ICA，颈内动脉的结扎是暂时的。2.4 插线栓在ECA距分叉处4mm处，用显微剪头朝下剪一弧行小口，此时注意是否有血持续渗出，若有，表示结扎不牢，可尝试拉紧结扎线，切记此时不能松开动脉夹，否则会造成大出血。接着夹持线栓由ECA上的切口向分叉方向插入，左手可提拉起ECA头端地结扎线固定血管，镊子夹太紧会使线栓头变形。待鱼线进入CCA后放手，然后用备好的结扎线栓紧切口，注意不能越过OA，否则会持续出血，必要时可结扎OA，此时结扎的松紧度非常重要，过紧则线栓插入困难，过松则会出血、脱落，以松开动脉夹后不出血为度。剪掉多余线头，剪断ECA，然后用两个弯镊一面夹住己经进入的鱼线和血管，一面夹住外面的鱼线，进行递送，在分叉处倾斜巧度角转向进入ICA，遇到动脉夹阻挡后，松开动脉夹，继续向内插入。插入约10mm左右，有时会感觉有阻力，是由线栓穿颅时遇到狭窄所致，此时硬行推入易损伤血管。应将线栓缓缓退至切口处，调整方向再缓慢插入，技巧是一手用显微镊向上抬起ICA靠颅段，另一手持镊子稍下压使线栓尽量保持水平插入，约当线栓标记点靠近切口时，即插入16-18mm左右，感觉到轻微阻力时停止插入，不宜超过20mm，切记操作者动作一定要轻柔，否则易导致蛛网膜下腔出血而死亡。应注意线栓在血管里多次进退可诱发血小板、白细胞劲附，损伤或刺激血管内皮细胞引起某些活性物质释放诱发血栓，造成动物存活时间缩短10。2.5 缺血与再灌注线栓插入成功后，记录缺血开始的时间，浸泡过生理盐水的脱脂棉球覆盖伤口。给大鼠保暖。缺血90 min后缓慢拔出鱼线，拔线时速度过快或麻醉不好大鼠抽动，会引起蛛网膜下腔出血甚至拉断血管，导致大鼠死亡。在缺血的90min时间里，中途需要补充麻醉，根据实验经验，若造模耗时在30min以内，在缺血1小时后可再次注射0.2-0.3ml水合氯醛，这里要注意不要注射过多，容易死亡。若大鼠有牙齿挫动或手脚抽动为苏醒前指征，此时注射麻醉效果减弱，若大