不同免疫增强剂对蛋鸡新城疫疫苗免疫效果影响试验.doc

不同免疫增强剂对蛋鸡新城疫疫苗免疫效果影响试验 （哈尔滨中科生物工程有限公司 赵前） 免疫调节剂是用于调节和控制免疫功能的药物，包括免疫抑制剂和免疫增强剂。免疫增强剂是一类单独使用或与抗原同时使用、通过非特异性途径增强机体免疫应答的物质，可增强机体的免疫功能，缓解由环境造成的免疫功能紊乱，有利于预防和治疗传染性和条件性疾病。目前在临床上常用的免疫增强剂有黄芪多糖、卡介苗、盐酸左旋咪唑、香菇多糖、VC、VE、硒、白细胞介素-2（白介素-2）等。本试验选用黄芪多糖粉剂、盐酸左旋咪唑、VE、VC作为免疫增强剂，以探明不同免疫增强剂对蛋鸡新城疫免疫效果的影响。1 材料与方法1.1 试验动物 1 日龄健康海兰褐蛋鸡，购于泰安东岳种禽有限公司。1.2 试验材料 96 孔V 型微量反应板、移液器、生理盐水、1%鸡红细胞悬液。 新城疫血凝抑制试验抗原由中国科学院提供；鸡新城疫灭活疫苗（La Sota 株）购于乾元浩生物股份有限公司。 黄芪多糖粉剂、盐酸左旋咪唑、VE、VC由ACV健康养殖工程中心提供。 RPMI 1640 培养液（Gibco 公司）；CKK-8、刀豆蛋白A（ConA，Sigma公司）。 小牛血清、Hanks液、台酚兰、肝素钠。1.3 试验动物的处理 600 只健康海兰褐蛋鸡随机分为A、B、C、D、E 5 组，每组120 只。试验在相同的环境下，采用同种饲料进行饲喂和同一防疫程序进行免疫预防。50 日龄防疫新城疫系和新城疫灭活疫苗时，免疫增强剂在防疫前后（4852 日龄）连用5 d。A 组使用预防量的黄芪多糖粉剂，B 组盐酸左旋咪唑10 mg/kg 拌料，每天早晚各一次，C 组VE 80 mg/kg 拌料，D 组VC 100 mg/kg 拌料，E 组不加免疫增强剂，作为对照组。1.4 抗体水平检测 分别于免疫前1 d 和免后第7、14、21、28、35、42 天，每组随机抽样15 只鸡翅静脉采血，分离血清，采用血凝（HA）与血凝抑制试验（HI）（高致病性禽流感诊断技术中华人民共和国国家标准GB/T 18936-2003）检测抗体效价，计算每组平均值，结果以log2表示。1.5 ConA诱导的鸡血液T淋巴细胞转化试验 分别于免疫前1 d 和免后第7、14、21、28、35、42 天，每组随机抽取15 只鸡翅静脉采取抗凝血，将1.5 mL 抗凝血与1.5 mL 细胞培养液（1640，不含胎牛血清）混匀；在灭菌离心管中加入3 mL 淋巴细胞分离液，并将3 mL 混匀血液轻轻的平铺在淋巴细胞分离液表面，1 500 r/min 离心20 min；将离心分层的淋巴细胞吸出，转到1.5 mL 离心管中，加入细胞培养液（1640，不含胎牛血清）重悬，3 000 r/min 洗涤两次；将淋巴细胞悬浮于1640 细胞培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为1107个/mL。将调整好的细胞悬液加入96 孔细胞培养板，每孔加99 L，然后实验组加入1 L ConA（终浓度为10 g/mL），对照组加入1 L 细胞培养液（1640，含胎牛血清），空白对照加入100 L 细胞培养液（1640，含胎牛血清）。每个样品作两个平行。将铺好的96 孔细胞培养板放入5%CO2，37 培养箱中培养48 h；每孔加入终浓度10 L CCK-8，放入二氧化碳培养箱，孵育1 h 后用酶标仪（OD450）读数，并计算刺激值。2 结果2.1 不同免疫增强剂对新城疫抗体水平的影响 不同日龄雏鸡新城疫（ND）抗体水平结果见图1。 图1 不同日龄雏鸡新城疫抗体水平结果（log2） 由图1 可知，试验A、B、C、D 组对ND 体液免疫水平的提高均有一定的效果。从70 日龄前抗体提升的速度及达到的峰值水平上来看，A 组、B组、D 组更具有优势，且A 组整体抗体水平消减曲线走势较好。 由于各试验组ND 基础抗体水平不同，所以对免疫后抗体滴度增加值进行了比较。 由图2 可以清楚看出，各组免疫增强剂对ND 体液免疫都有一定的作用，免疫后1 周内效果比较明显，A、B、D 组与E 组差异显著（P0.05），免后14 d D组与E组差异显著（P0.05）。 图2 免疫后不同日龄抗体水平与免疫前抗体水平的差值比较2.2 不同免疫增强剂对新城疫疫苗T 淋巴细胞转化率的影响 不同免疫增强剂对新城疫疫苗T 淋巴细胞转化率的影响见图3，由图3 可以看出试验A、B、C、D、E组与对照组相比，均具有提高T淋巴细胞转化能力和提高细胞免疫的作用，从免后21日龄前，A、B、D组效果更明显，B组ND细胞免疫水平最好。 图3 不同免疫增强剂对鸡T淋巴细胞转化率的影响3 讨论 体液免疫是机体抵抗传染病的主要因素之一，抗体是介导体液免疫的重要分子，抗体效价的高低直接反映机体的体液免疫状态。免疫增强剂能够促进抗体的产生，延缓抗体的下降或消失。由试验可知，黄芪多糖粉剂、盐酸左旋咪唑、VE、VC均能有效促进鸡新城疫抗体的产生，提高机体免疫水平。其中，黄芪多糖粉剂、盐酸左旋咪唑、VC效果更明显，从动物性食品安全角度考虑，黄芪多糖属中草药制剂，VC属于水溶性维生素，在养鸡生产中合理应用，既可以提高免疫效果，提高疫苗的保护率，延长免疫期，又无副作用，无残留等优点，符合绿色环保的要求，对人的健康不会产生不良影响，符合市场的需求，更具推广应用价值。 VE可以促进免疫系统的发育，增强机体的免疫机能和对传染病的抵抗力。本试验中应用VE产生的体液免疫效果不如其他免疫增强剂，这可能与维生素E 和硒的适度配合效果更好有关。 细胞免疫反应过程主要包括淋巴细胞的增殖与分化，淋巴因子的分泌。免疫的主要效应细胞是T 细胞、自然杀伤细胞和NK 细胞。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。经试验，黄芪多糖粉剂、VC、VE、盐酸左旋咪唑与对照组相比，均能提高T淋巴细胞的转化率，其中盐酸左旋咪唑效果最好。这表明盐酸左旋咪唑在促进外周血淋巴细胞分化、调节细胞免疫功能效果显著。 本研究中黄芪多糖粉剂、盐酸左旋咪唑、VC对新城疫疫苗的免疫效果各有优势，能否将它