硝化细菌的分离研究.doc

硝化细菌的分离研究j996年2月第16卷第l期西北大学(自然科学版)JournalofNorthwestUverslty(NaturaIScienceEdition)Feb.1996V01.26No.1;一6硝化细菌的分离研究/郭爱莲李振海黄淑萄_一,(1)西北大学生物系,710069.西安;2)西安交通大学,710049,西安第一作者伯岁,女.副教授)摘要对硝化细菌的分离方法进行j研究,通过加富培养阶段不同条件的对比,不同平板的-合适配方及制备对比,寻找出j一种较好的分离方法,有利于进一步开展对此菌的研究I作.关键词硝化细菌;分离;硅胶平板;制备分类号Q939硝化细菌为专性化能自养细菌,它包括硝化细菌和亚硝化细菌两个亚群硝化作用的过程由两个连续而又不同的阶段所组成,第】个阶段.氨氧化为亚硝酸,2NH.2-30一2HNo+2H.O,第2个阶段,亚硝酸氧化为硝酸,2HNOz-Oz一一2HNO.,释放出的能量也同样部分地用于还原CO.,合成细胞物质.硝化细菌通常生活在土壤和水中硝化细菌在自然界氮素循环中起着重要作用,硝化作用主要是由硝化细菌引起的,硝化细菌在氧化氨成为硝酸的过程中获得能量.并利用空气中的二氧化碳合成苗体有机物,是严格需氧菌土壤中硝酸盐的形成.对土壤氮素养分的转化具有重要意义.硝化细菌在耕作土中的存在数量和硝化作用强度叉被认为是土壤肥力的指标之一.另外,硝化细菌也常在工业循环冷却水系统中存在-特别是石油,化工,钢铁等工业用循环水中,它能利用氨使之变成硝酸,在台成氨厂,它利用泄漏的氨使原来因漏氨而上升的pH值降下来,菌的产酸可导致金属腐蚀,给工业生产带来危害.硝酸的过多积累污染了环境,故而引起了广泛的重视但硝化细菌绝大多数都是专性化能无机营养菌.一般的种类不能在有机培养基上生存,也不需外源生长固素,对营养的要求,专一性很强.在实验室对硝化细菌的分离通常较为困难,以致有关它们的细菌学和生物化学的研究工作进展缓慢.主要原固是,硝化细菌的代时长.平均在10h以上,伴生的异养细菌生长迅速,超过硝化细菌.而一般细菌代时约几十分钟,繁殖速度快.另外.硝化细菌具有生长在固体表面的习性.即使在液体培养基上,它们也往往附着在不溶性固体颗粒或器壁表面上.粘连在一起,给分离工作带来不便.我们在实验室中多次用不同的方法分离,并给予不断改进,找出了在普通实验室中较易掌握的方法,用本方法分离硝化细菌纯度高,花费较步.具有推广价值.1材料和方法1.1土壤和污泥样品来源见表1l_2培养硝化细菌用的培养基1.2.1硝化细菌富集培养基(NH.)2SO,0.5g,KH2PO.,0.07g,MgSO?7H2O,0.05g,CaC12?2H20-0.O5g,蒸馏水100mL,用5Na2CO调pH8.0.用此培养基培养亚硝化细菌.若培养硝化细菌?国家自然科学基金资助课题收稿日期:19940ll】84西北大学(自然科学版)第26卷可用0.2g,1D0mL的KNO2代替(NH.)2?SO.其他成分相同在0.1MPa的蒸气压下灭菌30rain.1.2.2硝化细菌分离培养基A液:(Nil4)O,11.0g;MgSO7ilzO,l-4g;FeSO.7ilzO,0?3g蒸馏水.100mLB液:Kil2PO,1.36g.蒸馏水100mL将A,B液按9:1的比例混合,用0.1N的NaOil调pH至8.08.2.在O.1MPa的蒸气压下灭菌3Orain,此培养基用于亚硝化细菌的分离,若分离硝化细菌,可用2.59/10DmL的KNO:代替(Nil)zSO.,其他成分相同.配制水洗洋菜平板,可按2的比例加入水洗洋菜做凝固剂,灭菌后备用,即成为分离硝化细菌的水洗洋菜平板.水洗洋菜制法是:把市售洋菜(琼脂在蒸馏水中浸泡23d,再用蒸馏水冲洗35次,直到洋菜呈白色透明,烘干待用.表1污泥样品来源及编号Tab.1SourceandNumberoftheSludge1.2.3硅胶平板硅胶平板是用硅酸钠或硅酸钾溶液.经盐酸或硫酸中和形成的凝胶.硅狡板的制法是用蒸馏水】40mL,加浓硫酸(比重1.84)5mL,男取蒸馏水170mL,加浓盐酸(比重1.19)20mL.将两种酸液混合,即为稀酸液.称硅酸钠51.g,加蒸镏水3】3mL溶解即成水玻璃将稀酸与水玻璃的比例按2;1混合,几分钟后,就能形成乳白色的硅胶板,放入水槽用流水浸洗至氯离子消除(用l硝酸银检查浸洗水).用开水浸洗几次.无菌水洗几次.倒置稍干.为了使制好的硅胶板变成培养基.每一培养皿需加硝化细菌分离培养基(见1.2.2中所述)2mL作为菌培养的营养液,放人50.C60.C温箱中,去盖烘至表面无营养液流动为止,即成为分离硝化细菌的硅胶平板.1.3实验方法1.3.1富集培养把所取土样称取lg接入到内盛】0mL富集培养液的试管中,置30.C恒温箱内富集培养.每隔几天用格利斯试剂在自瓷板上检验No的生成,培养78d后培养液遇格利斯试齐呈现红色,表示有亚硝酸盐存在或检测No的存在.用二苯胺试剂遇培养液呈蓝色,说明有硝酸细菌的存在,表示亚硝酸已被氧化成硝酸.用显色深浅来判断作用的强弱,选出作用强的试管,吸取2滴培养液接人到盛有新鲜培养液的试管中.继续培养并进行同上面所述的测试,经过几次重复操作,可以不断淘i盘其他异养菌,并在连续转移的富集培养中,不断补加NaNO:,增加培养的硝化细菌数量.1.3.2分离分离前将富集培养液通CO0.5h,在水洗洋菜做凝固剂所配制的平板和硅腔平板上用富集培养液分别接种,可以用涂布法嘴富集液均匀涂布,也可以用划线法将富集液划线.30C培养几周后.当长出针尖大的菌落时,将菌种重复接到富集培养液中,经液体培养检验,再继续重复,涂布,如此反复几次,即可得到纯化了的菌种.2结果和讨论21补加亚硝酸钠对比实验结果表明,在硝化细菌的加富培养中.一方面要注意重复数次培养,另一方面要注意向培养液里补加NaNOz.通过实验对比,在培养液里添加NaNO:的效果要比不加的好,硝化细菌的个数增多,加过试剂的培养液颜色较深,结果见表2.加富培养为硝化细菌的生长繁殖创造了有利条件.使它较其他种类微生物生长快.因为NaNO:可以有效地抑制杂菌生长,增加硝化细菌的数量,为硝化细菌的生长不断补加能源和氮源,为进一步的分离打好基础.在富集培养时,要考虑硝化细菌生长的环境,即它对生长最适条件的要求,如硝化细菌生长的最适温度为30C36C,在培养中我们选择30.C,主要考虑了采集的土样为中温带土壤;硝化细菌第1期郭爱莲等:硝化细菌的分离研究85一般在中性或微碱性条件下生长最好,我们将培养基的pH调至8.08+2左右.培养要在含铵盐或亚硝酸盐等的无机培养基中,而不能是有机培养基,这是因为在实验室常用的有机质培养基上,硝化细菌不能生长,有机质成分对它们有毒害作用.培养中注意多方面条件的综合配合,反复摸索总结,严格控制操作,有利于进一步分离成纯培养.表2补加NaNO的对比实验结果Tab.2ComparativeResultwithReplenishedNaNo*以术诜洋菜平板和硅肢平板分离菌种2.2二氧化碳通量对比富集培养液在分离纯化之前,通CO0.5h,再在水洗洋菜和硅胶平板上分离菌种.结果表明,通入CO:的富集培养液分离效果好.表3CO.对分离结果的影响Tab.3CO2Effect.onIsolatedResult这是因为硝化细菌具有生长在固体表面上的习性.即使在液体培养基中,它们也主要附着在培养基中的固体颗粒或器壁上,通COz可使附着的硝化细菌从附着物上游离下来,提高细胞的自由分散度,有利于分离工作的进行.2+3硅胶平板和水洗洋菜平板对比30C培养两周后,在水洗洋菜的平板上出现略显黄色的微小菌落,革兰氏染色后镜检为杆状的革兰氏阴性菌,无有芽孢.在一些平板上出现G一球状菌.单个.在硅胶平板上培养的时间更长,30.C培养约3周后,在一些平板表面出现浅黄色的菌落,镜检为无芽孢的G一杆菌或单个G一球菌.通过在有机培养基如:肉汁胨培养液,麦芽汁,肉汁蛋白胨固体斜面,麦芽汁斜面,肉汁葡萄糖斜面,土豆斜面等上接种,均未发现生长.表4两种培养基平板上培养结果Tab.4CultureResultO11TwoPlates通过几次分离对比看出:硅胶平板和水洗洋菜作凝固剂的平板均可分离纯化硝化细菌.而且效果均较好.硅胶平板长得时间较长,菌落不易观察,选择性强.水洗洋菜平板容易培养,生长时间较短,但容易出现杂菌生长,故各有特点.另外,在制硅腔平板时,稀酸液和水玻璃按ltl混合后仅出现少量白色絮状沉淀?不能形成硅胶平板.这种硅胶平板可用沸水烫洗而不溶化,但不能高温高压灭菌.后经多次的重复试验得出,当稀酸液和水玻璃的比例达到2t】时,几分钟后就能形成乳白色的硅胶平板,效果很86西北大学(自然科学版)第26卷好.许多书中关于硅胶平板的制备均较麻烦.如硅酸钠液与盐酸溶液混合后需经透析,我们曾在实验室透析.不仅要用透析袋.而且要用无离子水多次换水.感觉到麻烦而且花费较大.另外,用树脂柱法进行硅酸溶剂的制备,程序复杂,而且用品较多.对比起来,我们摸索改进的这两种方法简单易行.适合一般实验室操作和进行研究硅酸胶平板因具有高度选择性,可不加热灭菌,用开水浸洗几次,无菌水冲洗几次即可.水洗洋菜平板也较易制得.另外,在分离时要注意使平板保持一定的湿度.因为硝化细菌代时长,30.C培养几周才能生长菌落,而且菌落较小经过几次改进,我们在培养时采用在一大烧杯中放入培养的平板,周围放一些加水的棉花球,盖上玻璃板,在温箱中培养以防干裂,取得了较好的效果.硝化细菌的分离比较困难,而且长成后的菌落很小,直径约100gm左右,比我们常见的细菌单菌落小得多,肉眼不易观察.往往容易忽略,这就需要我们认识硝化细菌的菌落特点,有利于分离纯化工作的进行.参考文献l郑士民,颜望明,钱新民.自养微生物.北京:科学出版社,t98326292PckoriusPRControllingcorrosivemieroorganlsmincooling-waters3tems.ChemicalEngineerin口.1978,95(23):111l7d3钱存柔编.微生物学实验.北京:北京大学出版社,t985.96974日微生物研究法讨论会编.微生物学实验法.程光胜,李玲蔺.张启先译.北京科学出版社,198t.505菌种保藏手册编写组.菌种保藏手册.北京:科学出版社,1980.i87195;2tt212责任编辑徐棠平IsolationandReasearchonNitobacteriaGuoAi1JanLiZhenhaiH118120Shuu2)(1)DepartmentofBiology.NothwestUniversity,710049.xjan2)XJanaotongUniversity.710069,xian)AbgtractAresearchontheisolatingmethodofnitrobaete