三羟异黄酮对高转移卵巢癌细胞株HO8910PM的侵袭、转移及MTA1、nm23H1基因表达的影响.doc

三羟异黄酮对高转移卵巢癌细胞株HO8910PM的侵袭、转移及MTA1、nm23H1基因表达的影响【摘要】目的：研究三羟异黄酮（genistein）对人高转移卵巢癌细胞HO8910PM转移相关能力的影响及其作用的机制。方法：以台盼蓝拒染法检测genistein对高转移卵巢癌细胞HO8910PM细胞增殖的影响；用Transwell小室法检测genistein对HO8910PM细胞的侵袭能力和趋化运动能力的影响；RTPCR分析MTA1及nm23H1 mRNA的表达。结果：50mol/L的genistein作用细胞6h后能抑制HO8910PM细胞体外侵袭人工基底膜和趋化运动能力,抑制率分别为(21.083.12)和(17.152.01)；25100mol/L genistein作用HO8910PM细胞24h后，明显下调MTA1 mRNA的表达，上调nm23H1 mRNA表达水平。结论：genistein能抑制高转移卵巢癌细胞HO8910PM的侵袭和运动能力。genistein抗肿瘤侵袭转移的作用机制与MTA1 mRNA的表达下调和nm23H1 mRNA表达上调有关。 【关键词】 异黄酮；侵袭；运动；转移；卵巢癌；MTA1；nm23H1Effects of genistein on the abilities of invasion and metastasis and on the expression of MTA1and nm23H1 mRNA in the highly metastatic ovarian carcinoma HO8910PM cells in vitro MA Weilie，DING Hang，FU Weiyu，ZHOU Keyuan （Department of Biochemistry，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，China） 【Abstract】Objecctive:To investigate the effect of genistein on the metastasis associated abilities of the human highly metastatic ovarian carcinoma HO8910PM cells and its possible mechanism.Methods:A trypanblue staining was used to examine the effect of genistein on proliferation of HO8910PM cells at 6 hours after the treatment；Transwell Chamber assay was performed to determine the effect of genistein on the invasive and migratory abilities of the cells；The expression level of MTA1 and nm23H1 mRNA was assessed by RTPCR analysis.Results: Genistein significantly inhibited the invasive and migratory abilities of HO8910PM cells in vitro，with inhibitory rates of (21.083.12)% and (17.152.01)%, respectively, at 6 hours after the treatment with 50 μmol/L genistein; Genistein distinctly downregulated the expressions of MTA1 mRNA and upregulated the expressions of nm23H1 mRNA in HO8910PM cells treated with 25100μmol/L genistein for 24 hours.Conclusion: Genistein might inhibit the migration and invasion of HO8910PM cells in vitro possibly through reducing the expression level of MTA1 mRNA and increasing the expression level of nm23H1 mRNA, which suggests that genistein be a potential drug to inhibit tumor metastasis. 【Key words】 genistein；invasion； migration；metastasis；ovarian carcinoma；MTA1；nm23H1三羟异黄酮（genistein）是大豆异黄酮的一种重要成分，主要存在于豆类植物中，具有广泛的生物学作用，如抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗氧化、抗突变等，其中genistein抑制肿瘤的血管生成是当前的研究热点之一。MTA （matastasisassociated gene）是近年来发现的一组与肿瘤转移密切相关的基因，包括MTA1、 MTA2和MTA3等2，有研究表明MTA1在mRNA水平与多种肿瘤的侵润转移密切相关3。nm23基因(nometastatic gene 23)是steeg等4用差异克隆杂交技术,在具有不同转移潜力的7种鼠K1735黑色素瘤细胞系cDNA文库中克隆出来的一种转移抑制基因。人类nm23基因有5种亚型,最早报道为nm23H1和nm23H2两个亚型5。nm23H1 mRNA表达与多种肿瘤转移有关,nm23H2 mRNA与肿瘤的关系研究较少。本文用体外实验的方法研究genistein对HO 8910PM细胞侵袭和运动能力的影响,并用RTPCR的方法检测genistein对MTA1 mRNA和nm23H1 mRNA表达的影响,探讨genistein抗肿瘤侵袭转移的可能作用机制。1 材料与方法 1.1 实验材料 人高转移卵巢癌细胞(HO8910PM)购自上海细胞生物所,由浙江省肿瘤研究所许沈华等6建立。细胞在含体积分数为10%小牛血清,1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI 1640完全培养基中,37、5%CO2（体积分数）饱和湿度孵箱培养。细胞经过消化传代,取对数生长期的细胞进行培养。 1.2 药品与试剂 超级小牛血清购自杭州四季青公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；PVPF滤膜(孔径8μm，直径13mm)购自Osmonics公司；Fibronectin购自Sigma公司；Matrigel购自BD公司；4×上样缓冲液(125mmol/L TrisHCl，pH6.8，4%SDS，10%β巯基乙醇，20%甘油，0 .04%溴酚蓝)； RTPCR试剂盒购自Qiagene公司；100bpDNAmarker购自华美生物工程公司；genistein购自sigma公司,实验前用DMSO溶解,培养液稀释,DMSO终浓度为0.1(实验证明该浓度对细胞无影响)。1.3 台盼蓝拒染法测定异黄酮作用6h对HO8910PM细胞增殖的影响 选取对数生长期的HO8910PM细胞,经胰酶消化、台盼蓝染色后在血球计数板上计数,确保活细胞在97%以上。调整细胞浓度为每孔2.5×104个(每孔250μL),加到24孔培养板中。将培养板放入37、5%CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后取出培养板,加入不同浓度genistein 1μL,使其终浓度分别为25、50、100、200μmol/L，每个浓度设3个平行孔；同时设置空白对照组和溶剂对照组。培养板放回孵箱继续培养6h,取出培养板,以台盼蓝活细胞拒染法计数活细胞，计算药物对细胞的增值抑制率（IR）。细胞增殖抑制率(IR%)=(对照组细胞计数处理组细胞计数)/对照组细胞计数×100%。 1.4 重组基底膜侵袭、趋化性运动实验7 将PVPF滤膜用指甲油manicure贴在Transwell小室上,风干。在膜的外表面涂纤粘蛋白Fibronectin(5g/10L),置超净台内风干,膜内表面涂基底膜成分Matrigel5μg(10μL),使之干燥,形成人工重组基底膜；在24孔板内加入0.1BSA RPMI1640，每孔600μL。收集对数生长期的HO8910PM细胞,悬浮于含0.1BSARPMI1640培养基中,终浓度为1×109/L。将Transwell小室浸于24孔板的条件培养基中,每个小室加细胞悬液100μL,再分别加入不同浓度genistein 1μL,使其终浓度分别为25、50μmol/L,对照组加入等量的PBS。37、5%CO2温箱内孵育6h。将Transwell小室取出,滤膜用甲醇固定1min,苏木精染色3min,水洗,伊红染色10s,水洗,用PBS浸湿的棉签擦去滤膜内表面的细胞；用封片胶将滤膜封于载玻片上,于400×显微镜下计数穿过PVPF滤膜的细胞数。每膜计数上下左右中5个随机不同视野,每组平行设3个滤膜。运动实验与侵袭实验相比,只是PVPF滤膜上不需铺Matrigel。 侵袭抑制率(IR%)=(对照组穿膜细胞数-给药组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数×100%运动抑制率(IR%)=(对照组穿膜细胞数-给药组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数×100%1.5 半定量RTPCR检测MTA1及nm23H1基因的mRNA表达 (1)总RNA的提取：分别收集以PBS、和25、50、100μmol/L genistein处理24h的HO8910PM细胞，按Trizol试剂盒说明提取总RNA。(2)引物设计与合成：nm23H1引物设计参照文献8，引物序列为：sense primer：5’AGG GCA GAC CAC ATT GCT TTT C3’，antisense primer：5’GCT GGG AGG AAG CAT TTT TAA TC3，扩增产物长度为185bp。MTA1引物设计参照文献8,引物序列为：sense primer：5AGC TAC GAG CAG CAC AAC GGG GT3， antisense primer：5’CAC GCT TGG TTT CCG AGG AT3，扩增产物长度为290bp。以GADPH为内参照,引物序列为：sense primer：5’ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’，antisense primer：5TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3’，扩增产物长度为452bp。引物均委托上海生工生物工程公司合成。(3)扩增条件：50逆转录30min，5预变性15min，循环35次(9430s，501min，721min)，再72充分延伸10min。取5μL PCR产物加1μL 6×上样缓冲液混匀（含荧光燃料GreenI），1.8%琼脂糖凝胶在100V恒压电泳约40min，紫外透射仪观察结果并拍照。相片经扫描仪扫描后,用图像分析软件ScionImage进行光密度积分值分析,计算出heparanase分别与内参照GAPDH的光密度积分值之比作为heparanase的相对含量值。 1.6 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件包进行方差分析。2 结果2.1 genistein作用6h后对HO8910PM细胞增殖的影响 分别用25、50、100μmol/L的genistein作用HO8910PM细胞6h后，台盼蓝拒染法测定细胞增殖抑制率，结果表明，100μmol/L genistein作用细胞6h后,细胞增殖抑制率为(11.262.35)%；而当genistein的浓度为25、50μmol/L时,细胞增殖抑制率均少于10%,且与对照组相比,差异无显著性(P0.05),可以认为genistein处理6h后对细胞增殖无明显的影响,故选择25、50μmol/L的异黄酮作为体外侵袭和趋化性运动的实验浓度。结果见表1。表1 genistein作用6h后对HO8910PM细胞增殖的影响 （略）与对照组相比较, *0.01。2.2 genistein对HO8910PM细胞侵袭基底膜成分能力的影响 用25、50μmol/L的genistein处理HO8910PM细胞6h后,能明显抑制细胞体外侵袭基底膜成分Matrigel的能力,其抑制率分别是(10.791.42)%和(21.083.12)%,见表2,图1 A、B。 表2 genistein对HO8910PM细胞侵袭能力的影响（略）与对照组比较，* 0.01。2.3 genistein对HO8910PM细胞体外趋化运动能力的影响 用25、50μmol/L的异黄酮处理HO8910PM细胞6h后,细胞体外趋化运动能力明显降低,其抑制率分别是(9.231.68)%和(17.152.01)%,见表3,图1C、D。 表3 genistein对HO8910PM细胞运动能力的影响（略）与对照组比较，* 0.01。图1A：对照（侵袭试验）；图1B：50μmol/L genistein（侵袭试验）；图1C：对照（运动试验）；图1D:50μmol/L genistein（运动试验） 图1 genistein对HO8910PM细胞的侵袭和运动能力的影响（×400）（略） 2.4 genistein作用HO8910PM细胞24h后对MTA1及nm23H1基因的mRNA表达的影响 用25、50、100μmol/L的genistein处理HO8910PM细胞24h后,RTPCR分析目的mRNA的表达。结果发现, genistein能够明显抑制MTA1 mRNA的表达，上调nm23H1 mRNA的表达,见图2、3。 M:DNA标准品；1道:对照组；2道:25μmol/L；3道：50μmol/L；4道:100μmol/L 图2 genistein作用24h后对MTA1 mRNA表达的影响（略）3 讨论 恶性肿瘤细胞的侵袭包括粘附、运动和降解细胞外基质或基底膜等步骤，是肿瘤转移的重要环节。抗侵袭和抑制基质蛋白酶活性的化合物均可抑制恶性细胞的侵袭和转移。本实验发现genistein能较为明显降低细胞的趋化运动能力，并下调MTA1 mRNA和上调nm23H1 mRNA的表达。 M:DNA标准品； 1道:对照； 2:25μmol/L； 3：50μmol/L；4:100μmol/L 图3 genistein作用24h后对nm23H1 mRNA表达的影响（略） MTA1是最近发现的一个新的肿瘤转移相关基因，MTA1 cDNA编码一个含703个氨基酸残基的蛋白质，分子量为79.4ku，其氨基酸序列中包含酪氨酸激酶、蛋白激酶C和酪蛋白激酶2的磷酸化位点。在蛋白分子末端发现一条富含脯氨酸的支链,其与SH3(the src homology 3 domains)结构域序列一致。SH3在信号传导通路中参与蛋白蛋白间相互作用，并与构成细胞骨架的组分有关。MTA1蛋白具有磷酸化位点和3结合位点,说明MTA1蛋白可与其他一些维持细胞正常功能的蛋白发生作用,在信号传导通路中发挥一定作用9。文献还报道了MTA1 mRNA在卵巢癌、胰腺癌、喉癌中的表达研究1012。提示MTA1基因在癌肿浸润转移中扮演重要角色,是参与转移的关键基因。MTA1基因产物可能通过调节细胞转录水平参与肿瘤的浸润和转移。 )nm23基因在高转移细胞株中表达降低,认为是肿瘤转移抑制基因。目前已发现,nm23H家族包括nm23H1、nm23H2、nm23H3、nm23H4、nm23H5、nm23H6等多个成员，其中主要是nm23H1,表达的相应的蛋白产物是二磷酸核苷酸激酶(NDPK)。NDPK是一类广泛存在的酶,它在细胞信号传递过程中能使GDP还原为GTP，从而激活G蛋白，在肿瘤的生长和发育过程中有微管的聚合和解聚，此过程需要GTP，故nm23H1异常表达影响了细胞骨架，从而引起细胞运动，参与侵润转移和发育过程13,与肿瘤的血管侵蚀和淋巴转移都有关。 我们的研究发现,用genistein处理HO8910PM细胞24h后,明显下调细胞MTA1 mRNA和上调nm23H1 mRNA的表达。这可能是genistein抗HO8910PM细胞侵袭转移的作用机制之一,具体的原因与机制有待于更深入的研究。【参考文献】 1POLKOWSKIK，MAZUREK A P. Biological properties of genistein .A review of in vitro and in vivo dataJ. Acta Pol Pharm，2000，57(2)：135155.2RAKESH K，WANG R A，BAGHERIYARMAND R. Emerging Roles of MTA Family members in human cancersJ. Semi Oncol，2003，30（5）：3037.3TOH Y，OHGA T，ENDO K，et al. Expression of the metastasisassociated MTA1 protein and its relationship to deacetylation of the histone H4 in esophageal squamous cell carcinomasJ. Int J Cancer，2004，110（3）：362367. 4STEEG PS，BEVILACQUA G，KOPPER L，et al. Enidence for a novel gene associated with low tumor metastatic protentialJ. J Natl Cancer Inst，1988，80（3）：200203.5STAHL J A，LEONE A，ROSENGARD AM，et al. Identification of a second human nm23 gene，nm23H2J. Cancer Res，1991，51（1）：445447.6许沈华,钱丽娟,牟瀚舟,等.高转移人卵巢癌细胞系HO8910PM的建立及其生物学特性J.中华病理学杂志,1998,27(6):451452.7刘红岩,韩锐.金荞麦提取物抑制肿瘤细胞侵袭转移和HT1