高中生物 第4章 现代生物技术 第15课时 聚合酶链式反应技术同步备课课件 北师大版选修1.ppt

第15课时聚合酶链式反应技术 第4章现代生物技术 学习导航1 阅读教材p77 78内容 掌握pcr技术原理 2 结合教材p79 80内容 了解pcr技术的基本操作过程 讨论pcr技术的影响因素 重难点击1 简述pcr的原理 2 了解pcr技术的基本操作过程并讨论pcr技术的影响因素 一 pcr的原理 二 dna片段的pcr扩增和产物检测 内容索引 当堂检测 一 pcr的原理 基础梳理 聚合酶链式反应简称pcr 是一种体外迅速扩增dna片段的技术 这项技术中dna复制的过程和细胞内dna复制的过程是类似的 请结合已学习的dna分子结构和复制的相关知识 分析pcr的原理 1 dna的平面结构示意图 1 写出各个标号的名称 胞嘧啶 腺嘌呤 鸟嘌呤核糖 胸腺嘧啶 脱氧核糖 磷酸基团 胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸 氢键 碱基对 一条脱氧核糖核苷酸链 2 dna的两条链是反向平行的 为了明确表示dna链的方向 通常将羟基末端称为3 端 将磷酸基团的末端称为5 端 按此原则在图上方框内标出两条链的方向 答案左链上5 端 下3 端 右链上3 端 下5 端 2 细胞内dna复制条件分析 脱氧核糖核苷酸 两 dna双螺旋 合成dna子链 atp 3 端 3 pcr原理与反应过程 1 pcr概念 是一种的技术 它能以极少量的dna为模板 在几小时内复制出上百万份的dna拷贝 体外酶促合成特定dna片段 2 条件及作用 合成dna时所需要的特异引物 原料 耐热taqdna聚合酶 缓冲溶液 3 反应过程 变性 温度上升到 时 目的dna双链为单链模板 复性 温度下降到 左右 两种引物通过与两条单链dna结合 94 98 变性解旋 40 60 碱基互补配对 延伸 温度上升到 左右 溶液中的在耐热的 的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 循环 继续上述的3个过程 dna片段被不断的扩增 若开始加入了n个dna模板片段 理论上 循环n次后能获得个dna片段 72 四种脱氧核糖核苷酸 taqdna n 2n 聚合酶 1 pcr原理pcr反应与体内dna复制的引物在化学本质上是否相同 请分析原因 答案不相同 体内dna复制所需引物为rna聚合酶合成的一小段rna 但pcr反应时所用引物一般是人工合成的单链dna片段 问题探究 答案 答案 2 pcr反应过程 1 pcr反应中需要解旋酶和dna聚合酶吗 若需要 则与细胞内dna复制有何区别 答案pcr反应不需要解旋酶 但需要dna聚合酶 由于pcr反应中需要高温使dna解旋 因此pcr所需的dna聚合酶需耐高温 2 pcr的每次循环中应如何控制温度 请分析原因 答案每次循环中先高温解旋 再低温使引物与模板结合 最后适当升温有利于taqdna聚合酶发挥作用 3 结合下图分析pcr过程中dna复制的方向是怎样的 答案dna的羟基 oh 末端为3 端 磷酸基团的末端为5 端 当引物与dna母链通过碱基互补配对结合后 dna聚合酶就能从引物的3 端开始延伸dna链 dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 答案 pcr扩增与dna复制的异同 归纳总结 拓展应用 1 下列关于dna复制和pcr技术的描述中 正确的是a dna聚合酶不能从头开始合成dna 只能从5 端延伸dna链b dna复制不需要引物c 引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合d pcr扩增的对象是氨基酸序列解析dna聚合酶不能从头开始合成dna 故dna复制需要引物 dna聚合酶只能从3 端延伸dna链 而不能从5 端延伸dna链 引物通过碱基互补配对原则与dna母链相结合 pcr扩增的对象是dna 不是氨基酸序列 答案 解析 2 pcr技术有效地解决了因为样品中dna含量太低难以对样品进行研究的问题 而被广泛应用 与细胞内的dna复制相比 pcr可以快速扩增所需的dna片段 请分析回答下列有关问题 1 体内dna复制过程中用解旋酶打开双链dna 而pcr技术中的解旋原理是 解析pcr技术中用高温使dna分子中的氢键打开 从而解旋 其原理是dna的热变性原理 答案 解析 dna的热变性原理 2 此过程需要一种taqdna聚合酶 该酶是从中分离的 解析taqdna聚合酶是从水生耐热细菌taq中提取的 3 与普通dna聚合酶相比 taqdna聚合酶具有的特性是 解析与普通dna聚合酶相比 taqdna聚合酶在90 以上的环境中不变性 具有耐高温的特性 4 与体内dna复制相比较 pcr反应要在中才能进行 并且要严格控制条件 解析pcr反应需要适宜的温度和ph 因此pcr反应要在一定的缓冲溶液中进行 并需严格控制好温度条件 答案 解析 水生耐热细菌taq 耐高温 一定的缓冲溶液 温度 5 pcr中加入的引物有种 加入引物的作用是 解析pcr需要两种引物 引物的识别位点决定了pcr扩增的dna片段 pcr中加入的引物一般是一小段单链dna 作用是引导dna复制 可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键 成为dna复制的起点 答案 解析 2 作为dna复制的起点 细胞内的dna复制需要适宜的温度和ph吗 若需要 是如何实现的 答案需要 细胞内的适宜温度和ph与内环境的稳态有关 低等生物与环境因素有关 答案 与pcr原理有关的三个易错点 1 酶的作用位点 解旋酶的作用是使dna两条链之间的氢键断开 dna聚合酶与dna连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键 不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键 2 dna聚合酶和dna连接酶 dna聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3 端上 需要模板 而dna连接酶连接的是两条dna片段的缺口 不需要模板 3 pcr中的解旋过程 pcr过程中不需要解旋酶 需要升高温度才能打开氢键 但此时的温度不会破坏磷酸二酯键 因此 dna加热变性后变为单链 并未分解成单体 二 dna片段的pcr扩增和产物检测 基础梳理 dna片段的pcr扩增可以利用pcr热循环仪完成 而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行 阅读教材 完善下列内容 1 dna片段的pcr扩增 按照pcr反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上 用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分 盖严离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 准备 移液 混合 将微量离心管放在离心机上 离心约10s 目的是使反应液集中在离心管底部 将离心管放入pcr仪中 设置程序进行反应 1 加入离心管中的物质应包括 酶 4种 2种 缓冲液 2 离心管中要加入少量石蜡油 目的是 离心 反应 模板dna taqdna聚合 三磷 酸脱氧核苷酸 引物 防止反应溶液的挥发 3 热循环仪的反应程序应设定为 94 94 40 72 4 影响因素 在pcr实验中 需要扩增的dna片段的大小决定延伸的时间 片段越大 中温延伸的时间 引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择 如果引物越短 a t含量越多 复性温度就 反之引物越长 g c含量越多 复性温度就 这是因为g c之间是由 个氢键连接 a t之间是由个氢键连接 5 pcr过程中 循环次数是不是越多越好 答案不是 taqdna聚合酶在pcr扩增过程中存在1 10 5的出错几率 而且随着循环次数的增加 其活性也会逐渐降低 因此 pcr过程中 循环次数并非越多越好 一般控制在25 35个循环 越长 越低 越高 3 2 2 扩增产物的检测 1 原理 琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔 带有大量负电荷的dna分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动 dna片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小 因此大小一致的dna分子会在凝胶的一定位置形成dna条带 2 过程配制质量分数为1 的琼脂糖凝胶 制作成电泳胶板 在dna样品中加入0 2倍体积的混匀 载样缓冲液 取20 l加入内 v稳压电泳20 40min 当指示剂电泳到凝胶底部时 切断电源 将胶板浸入溶液染色5 10min 在上观察电泳条带 样品孔 80 溴酚蓝 溴化乙锭 紫外透射仪 问题探究 答案 1 实验过程分析 1 离心的目的是什么 在离心的过程中 微量离心管的盖子为什么一定要盖严 答案离心的目的是使反应液集中在离心管底部 提高反应效率 微量离心管的盖子一定要盖严 防止实验中脱落或液体外溢 2 在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁 目的是什么 答案离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀 3 pcr实验中使用的微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌 为什么这样操作 还有哪些操作与此目的相同 答案为避免外源dna等的污染 在微量离心管中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头都必须更换 2 结果检测 1 实验中为什么要测定dna的含量 答案实际操作过程中会有许多因素影响dna含量 所以需要对dna含量进行测定 答案 2 如何判断dna扩增成功 答案 可以通过计算dna含量来评价扩增的效果 电泳检测的方法 可以通过在紫外线下直接观察dna带的分布及粗细程度来评价扩增的效果 3 pcr扩增过程可能会出现哪些异常结果 答案样品产物少 或产生新的dna 答案 归纳总结 pcr扩增dna片段的操作要点 1 避免外源dna的干扰 所用仪器 缓冲液 蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌 2 缓冲液 酶 dna引物和dna模板等如果长期保存 需要在 20 冰箱内保存 其中 dna引物和dna模板要避免反复冻融 否则容易造成dna的降解 3 在用微量移液管混合pcr反应体系的各种成分时 一定注意避免各种溶液之间的相互污染 需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则 4 为防止dna引物与模板dna在室温非特异性结合进行pcr反应 需在冰盒上混合pcr扩增体系的各种组分 5 为避免反应过程中高温使ep管中的水蒸气溢出管外而导致pcr过程中各种成分的浓度发生变化 须在pcr反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发 拓展应用 3 使用pcr仪具体实验操作顺序应为 设计好pcr仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 进行pcr反应 离心使反应液集中在离心管底部a b c d 解析pcr反应的操作步骤一般分为准备 包括配制配方及将各配方放于实验台上 移液 混合 离心 反应 pcr仪是一种自动控制温度的仪器 设计好循环程序就可以进行反应了 答案 解析 4 近20年来 pcr技术 聚合酶链式反应 成为分子生物学实验室的一种常规实验手段 其原理是利用dna半保留复制 在试管中进行dna的人工复制 如图 在短时间内 将dna扩增几百万倍甚至几十亿倍 从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体 1 加热使dna双链间的键完全打开 称为 而在细胞中是在酶的作用下进行的 2 如果只需要大量克隆模板dna中间的某个特定区段 应该加入种特定的引物 当温度降低至40 时 引物与两条 舒展 的模板链的特定位置结合 在dna聚合酶的作用下 只能在引物的端连接脱氧核苷酸 两条子链的延伸方向都是 3 pcr技术的必需条件 除了模板 原料 酶之外 至少还有三个条件 即液体环境 适宜的和 前者由自动调控 后者则靠来维持 4 通过pcr技术使dna分子大量复制 如果将一个用15n标记的dna分子放入试管中 以14n标记的脱氧核苷酸为原料 连续复制四次之后 则15n标记的dna分子占全部dna分子总数的比例是 答案 解析 问题导析 氢 解旋 解旋 两 3 从子链的5 端向3 端延伸 温度 酸碱度 pcr仪 缓冲液 1 8 问题导析 1 解旋是使dna双链间的氢键断裂 pcr技术是利用dna的原理 细胞内是在酶的作用下解旋 2 dna分子不论复制几次 含有15n标记的dna分子都只有个 返回上页 答案 热变性 解旋 2 解析 1 pcr技术利用热变性原理使dna双链之间的氢键断裂 称为解旋 而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂 2 pcr分为三个基本反应步骤 变性 94 98 复性 40 60 延伸 72 其特异性依赖于与靶序列互补的引物 引物是两段与待扩增dna序列互补的片段 两引物之间的距离决定扩增片段的长度 由于dna聚合酶不能从头开始合成dna 只能从引物的3 端延伸dna链 则dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 3 pcr技术与细胞内的dna复制不完全相同 除了需要模板 原料 酶以外 至少还需要液体环境 稳定的缓冲溶液 每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等 4 一个dna分子连续复制四次之后 形成16个dna分子 15n标记的dna分子有2个 则15n标记的dna分子占全部dna分子总数的比例为1 8 返回上页 课堂小结 引物 复性 延伸 pcr仪 琼脂糖凝胶电泳 当堂检测 1 用于pcr的引物长度通常为20 30个核苷酸 是一小段a dnab rnac 单链dna或rnad 双链dna 2 3 4 5 1 答案 2 符合pcr反应条件的一项是 稳定的缓冲液环境 dna模板 合成引物 四种脱氧核苷酸 dna聚合酶 dna解旋酶 限制性内切酶 温控设备a b c d 解析pcr反应模拟的是生物细胞内dna复制的条件 只是无需解旋酶 可热变性 也不需要基因工程的工具酶 限制性内切酶 答案 解析 2 3 4 5 1 3 下列关于pcr的描述中 正确的是 pcr是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性 扩增dna利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列a b c d 解析pcr是一种体外迅速扩增dna片段的技术 在高温条件下 把dna的双链打开 缓慢冷却后 又重新结合 需要耐高温的dna聚合酶 同时 还需要引物 从引物的3 端连接脱氧核苷酸 答案 解析 2 3 4 5 1 4 下图所示为pcr扩增的产物 请分析此产物是哪次循环的产物 答案 2 3 4 5 1 解析 a 第一次循环b 第二次循环c 第三次循环d 第四次循环 2 3 4 5 1 解析在pcr反应中 以引物为标记 第一次循环时 以加入的dna为模板 两条dna链可分别由引物 和引物 与其结合并在dna聚合酶的作用下延伸 所以形成的dna中只有一种引物 从第二次循环开始