王峰 第06章 酶讲解材料

王峰 第06章 酶讲解材料 第六章酶Enzyme酶的概念?酶是生物体内由活细胞产生的，具有催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸，又称为生物催化剂。 （E）概述酶学研究简史?公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 ?一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。 ?1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。 ?1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。 ?1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。 ?1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。 ?1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。 酶所催化的体内化学反应称为酶促反应；被酶催化的物质叫底物（Substrate,S）；催化所产生的物质叫产物（Product,P） 一、酶的生物学意义 1、酶与一般催化剂的相同点*在化学反应前后没有质与量的改变；*只催化在热力学允许的化学反应；*只加速可逆反应的进程，而不能改变反应的平衡点。 第一节酶是生物催化剂（ （1）不稳定性酶是蛋白质，对外界环境极敏感。 任何导致蛋白质变性的因素都会使酶发生变性。 （2）高度催化效率使反应加快1031017倍倍 （3）高度专一性酶对所催化的底物有严格的选择性 2、主要特点（ （4）可调控性 （5）酶催化体内某些重要的合成反应。 ?对酶生成与降解量的调节?酶催化效力的调节?通过改变底物浓度对酶进行调节等 二、酶的专一性（酶对S的严格选择性）一种酶只能作用于一类化合物或一型化学键，发生一定的化学反应，生成一一定的产物。 这种酶对S的特异要求，即对S的严格选择，称之为酶的专一性。 一概念二分类 1、立体化学专一性（ （1）立体异构专一性作用于某种旋光异构体（D或L型其中一种）丙酮酸L-乳酸乳酸脱氢酶（ （2）几何异构专一性酶只能作用于顺反异构体的一种，这种专一性称为几何异构专一性。 HOOCCHCHCOOH+H2OCH COOH2CH(OH)COOH延胡索酸酶延胡索酸（反丁烯二酸)L（+）苹果酸 2、非立体化学专一性（ （1）键专一性作用于一类化学键（ （2）基团专一性作用于一种基团各种水解酶类磷酸酶ROP酯酶R1COOR2蛋白酶肽键如胰蛋白酶作用于赖或精氨酸的羧基形成的肽键（ （3）绝对专一性作用一种底物脲酶尿素锁钥学说（Fisher）及诱导契合学说（Koshland）酶活性中心的某些AA残基或基团可在S诱导下，其空间构象发生变化，于以使有利于ES的生成。 3、酶作用专一性的机理 三三、酶的分类与命名 一、酶的分类IEC（国际酶学委员会）1961年制定氧化还原、转移、水解、裂合、异构、合成 1234561、氧化还原酶类脱氢或加氢；加氧或脱氧；电子得失 2、转移酶类基团从一个化合物转移到另一个化合物 3、水解酶类水解某类化学键 4、裂合酶类从双键上去掉基团或将基团加至双键上；包括“裂”及“合” 5、异构酶类分子基团重排 6、合成酶类使二分子缔合 二、酶的命名一习惯命名法酶的或特点+底物名称+反应性质+酶”水解酶类，用底物名或加底物名来命名。 如蛋白酶（胃蛋白酶，胰蛋白酶）淀粉酶（唾液淀粉酶，胰淀粉酶）磷酸酶（酸性、碱性磷酸酶）二系统命名法 1、一酶一名S（S1S2）+反应类型例醇脱氢酶醇NAD+氧化还原酶 2、EC（酶号）四码分类编号（如如EC.1.1.1.1）EC.类亚类亚亚类序号底物反应的性质 一、酶的化学本质与分子组成单纯酶=蛋白质结合酶=蛋白质+非蛋白质（全酶）（酶蛋白）（辅助因子）按组成分类(holoenzyme)(apoenzyme)(cofactor)第二节酶的化学本质、结构与功能辅酶非共价松散结合，可用透析除去。 辅助因子辅基共价牢固结合，不能用透析除去。 小分子有机物维生素、铁卟啉无机金属离子Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+蛋白质辅酶化学本质丙酮酸乳酸NADH+H+NAD+乳酸脱氢酶例如异柠檬酸-酮戊二酸异柠檬酸脱氢酶NAD+NADH+H+结合酶的酶蛋白或辅助因子单独存在时无催化活性;只有当它们结合为全酶时才具有催化活性。 酶蛋白决定酶的专一性，辅助因子决定反应类型。 根据酶蛋白特点和分子大小分为单体酶只由一条多肽链构成的酶，称为单体酶。 (monomeric enzyme)寡聚酶由多个相同或不同多肽链亚基以非共价键连接的酶。 (oligomeric enzyme)多酶复合体即多酶体系（multienzyme system),是是在细胞内由几种不同功能的酶彼此聚合形成。 多功能酶即由一条多肽链组成却具有多种不同催化功能的酶。 （P137）(multifunctional enzyme) 二二、酶蛋白的结构（一）酶的活性中心和必需基团 1、活性中心酶分子中（表面的局部区域）由必需基团构成的，能直接与底物结合并并发挥催化作用的部位。 2、活性中心位于酶分子表面，呈口袋或裂缝状。 酶的活性中心酶的活性中心3.必需基团(essential group)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。 结合基团活性中心内催化基团-COOH、-NH 2、-OH、-SH、咪唑基。 活性中心外的必需基团SS?活性中心内的必需基团结合基团(binding group)与底物相结合催化基团(catalytic group)催化底物转变成产物位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。 活性中心外的必需基团底底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心一些酶活性中心的氨基酸残基酶残基总数活性中心残基牛胰核糖核酸酶124His12,His119,Lys41溶菌酶129Asp52,Glu35牛胰蛋白酶238His46,Asp90,Ser183木瓜蛋白酶212Cys25,His159弹性蛋白酶240His45,Asp93,Ser188枯草杆菌蛋白酶275His46,Ser221碳酸酐酶258His93-Zn-His95His117酶活性中心的几点说明?所占体积小，1%2%；?活性中心是个三维实体；?活性中心可发生空间结构的变化诱导契合；?位于酶分子表面的裂缝内，内部疏水，有利于催化。 二、酶的辅助因子（一）无机金属离子对酶的作用。 1、稳定酶构象，参与组成酶的活性中心 2、传递电子各种细胞色素（Cyt） 3、结合底物（桥梁作用）EM+S丙酮酸激酶，EMg2+ATP，使丙酮酸磷酸化 4、中和电荷金属酶金属离子和酶蛋白结合牢固金属活化酶酶蛋白不和金属离子结合，但发挥活性时离不开金属离子的存在。 1、维生素（Vit）概念维持细胞正常功能所必需、但需要量极少、许多动物体内不能合成而必须由食物提供的一类低分子有机化合物。 2、分类（公认为13种种）脂溶性（4种种）A、D、E、K水溶性（9种）（二）维生素与辅酶的关系B族B 1、B 2、PP、B 6、泛酸、生物素（H）、叶酸、B12VitC脂溶性维生素的主要生理功用VitA视蛋白的辅基感光（暗视光）（抗干眼病V）组织发育和分化VitD1,25(OH)2D3促进Ca、P的吸收（抗佝偻病V）与成骨VitE抗氧化，避免脂质过氧(-生育酚)化物的产生，保护生物膜抗不育（动物）VitK谷氨酸羧化酶的辅(凝血V)助因子，维持凝血因子、的正常水平维生素B1维生素B1又名硫胺素(thiamine)体内活性形式为焦磷酸硫胺素(TPP)（一）化学本质及性质 3、水溶性维生素与辅酶TPP是-酮酸氧化脱羧酶的辅酶，也是转酮醇酶的辅酶。 在神经传导中起一定的作用，抑制胆碱酯酶的活性。 （二）生化作用及缺乏症1.生化作用2.缺乏症脚气病，末梢神经炎维生素B2（二）生化作用及缺乏症生化作用FMN及FAD是体内氧化还原酶的辅基，主要起氢传递体的作用。 缺乏症口角炎，唇炎，阴囊炎等。 （一）化学本质及性质维生素B2又名核黄素(riboflavin)体内活性形式为黄素单核苷酸(FMN)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)维生素PP?维生素PP包括尼克酸(nicotinic acid)尼克酰胺(nicotinamide)?体内活性形式尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)（一）维生素PP是NAD+和和NADP+的组成成分.1.生化作用NAD+及NADP+是体内多种不需氧脱氢酶（如苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶）的辅酶，起起传传递氢的作用。 （二）维生素PP的作用2.缺乏症:癞皮病泛酸（一）化学本质及性质泛酸(pantothenic acid)又名遍多酸体内活性形式为辅酶A(CoA)酰基载体蛋白(ACP)（二）生化作用及缺乏症CoA及ACP是酰基转移酶的辅酶，参与酰基的转移作用。 生物素生化作用生物素(biotin)是多种羧化酶（如丙酮酸羧化酶）的辅酶，参与CO2的羧化过程。 CHSC HC H2N HCHNHO(CH2)4COOH与羧基结合生成羧基生物素与赖氨酸残基-氨基结合成生物胞素维生素B6（一）化学本质及性质维生素B6包括吡哆醇，吡哆醛及吡哆胺体内活性形式为磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺（二）生化作用及缺乏症磷酸吡哆醛是氨基酸转氨酶及脱羧酶的辅酶，也是?-氨基?-酮戊酸合酶（ALA合酶）的辅酶。 叶酸生化作用FH4是一碳单位转移酶的辅酶，参与一碳单位的转移。 缺乏症巨幼红细胞贫血（一）化学本质及性质（二）生化作用及缺乏症叶酸(folic acid)又称蝶酰谷氨酸体内活性形式为四氢叶酸(FH4)叶酸二氢叶酸还原酶NADPH+H+NADP+二氢叶酸二氢叶酸还原酶NADPH+H+NADP+四氢叶酸5,6,7,8-四氢叶酸N1N3CH6NH57NH8N H2O HCH29NH10CONHCHHOOC(CH2)2COOH维生素B12生化作用参与体内甲基转移作用缺乏症巨幼红细胞贫血、神经疾患（一）化学本质及性质维生素B12又称钴胺素(coholamine)体内活性形式为甲基钴胺素5-脱氧腺苷钴胺素（二）生化作用及缺乏症学名别别名辅酶（辅基）形式主要功能B1硫胺素、抗脚气维生素TPP（焦磷酸硫胺素） 1、a-酮酸脱氢酶系辅酶 2、转酮基酶辅酶B2核黄素FMN（黄素单核苷酸）、FAD（黄素腺嘌吟二核苷酸）递氢体、脱氢酶辅基B6吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺P-CHO（磷酸吡哆醛）P-CH2NH2（磷酸吡哆胺）AA转氨酶AA脱羧酶辅酶泛酸遍多酸CoA（辅酶A）ACP（酰基载体蛋白）酰基转移酶辅酶参与FA合成学名别名辅酶（辅基）形式主要功能PP尼克酸、尼克酰胺NAD+（Co，尼克酰胺腺嘌吟二核苷酸）NADP+（Co，尼克酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸）不需氧脱氢酶辅酶酶生物素（生物胞素）羧化酶辅酶、CO2载体叶酸FH4(四氢叶酸)一碳单位代谢辅酶B12钴胺素甲基钴胺素5-脱氧腺苷钴胺素氰钴胺素羟钴胺素转甲基酶辅酶参与相邻基团的转移反应分子较小，有更高的热稳定性。 金属离子、铁硫复合体和血红素是存在于这些蛋白质类辅酶中的反应中心。 如细胞色素是含有血红素辅基的蛋白质类辅酶（三）蛋白质类辅酶某些蛋白质起辅酶作用，它们自身不起催化作用，但为某些酶所必需，这些酶称基团转移蛋白或蛋白质类辅酶。 （一）酶的活性中心与酶作用的专一性酶催化的高效率及其对底物的高度专一性的基础是酶的特殊分子结构。 酶活性中心的空间结构决定了酶的专一性。 四、酶的结构与功能不同酶的活性中心是不同的，它只能结合并催化那些与之相适应的底物。 （这也说明了酶为什么具有专一性）酶酶底物（二）空间结构与催化活性保持活性中心的结构是维持酶活性必需的。 ?酶原(zymogen)有些酶(大多数是蛋白酶)在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。 ?酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。 （三）酶原的激活?酶原激活的机理酶原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下赖赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝S S S S46183甘甘异异缬缬组组丝丝S S S S肠激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活过程?酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。 有的酶原可以视为酶的储存形式。 在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。 第三节酶的作用机制 一、酶能显著降低反应活化能酶和一般催化剂一样，加速反应的作用都是通过降低反应的活化能(activation energy)实现的。 活化能底物分子从初态转变到过渡态所需的能量。 反应总能量改变非催化反应活化能酶促反应活化能一般催化剂催化反应的活化能能量反应过程底物产物酶促反应活化能的改变中间产物学说E+SESE+P PS底物（受酶催化的物质）ES酶与底物形成的中间复合物，ES结合为非共价结合,中间产物的产生生降低了反应的活化能，加快了反应的速度。 二、中间复合物学说和酶作用的过渡态反应历程A+B AB C+D反应产物中间产物产物（初态）（过渡态）（终态）酶底物复合物E+S E+P ES(过渡态)E+S ES E E+P P诱导契合趋近效应定向效应张力作用酸碱催化共价催化 三、酶作用高效率的机制（一）趋近和定向效应（见图）当A、B两底物分子结合于酶分子表面的某一区域，其反应基团互相靠近，降低了活化能，称为趋近效应。 酶可以使反应物在其表面对着特定的基团几何地定向，即具有定向效应。 趋近和定向效应（二）底物变形与张力作用（见图）底物与酶结合后，酶的活性中心的某些基团可以作用于底物的某些敏感键，从而使底物分子内部产生张力，底物扭曲,键易断裂，促进化学反应的进行。 底物变形与张力作用 3、共价催化作用E与S形成共价复合物。 （不稳定的中间复合物物）亲核催化，亲电子催化 4、酸碱催化作用酶可以作为质子供体（H，如如ECOOH）或质子受体（ENH2）或二者兼之而发挥作用。 第四节酶促反应动力学Kiics ofEnzyme-Catalyzed Reaction研究反应动力学的原因?为研究酶的结构与功能的关系提供证据；?为研究酶的作用机制提供证据；?寻找最有利的反应条件；?了解酶在代谢中的作用。 ?概念研究酶催化反应的速度及各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。 ?影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。 酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示V=S/t;或=P/t研究前提?在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。 一、底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对反应速度的影响是一种特殊的饱和现象。 E+P酶底物复合物E+S ES当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。 SV Vmax随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。 SV Vmax当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应SV Vmax（一）米曼氏方程式中间产物酶促反应模式中间产物学说E+S k1k2k3ES E+P1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程SKSVvmmax?1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。 S底物浓度V不同S时的反应速度V max最大反应速度(maximum velocity)m米氏常数(Michaelis constant)V maxSK m+S米曼氏方程式推导基于两个假设E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即Vk3ES。 (1)S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变。 米曼氏方程只适用于单底物、单产物的酶体系。 推导过程?稳态是指ES的生成速度与分解速度相等，即ES恒定。 K1(EES)SK2ES+K3ESK2+K3K m（米氏常数）K1令则 (2)变为:(EES)SK mES (2)(EES)SK2+K3ESK1得当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即EES，反应达最大速度V maxK3ESK3E (5)ESESK m+S (3)得:将 (5)代入 (4)得米氏方程式V maxSK m+SV将 (3)代入 (1)得K3ESK m+S (4)V当反应速度为最大反应速度一半时?K m值的推导K mSK m值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。 2K m+SV maxV maxSV maxVSK mV max/2（二）K m的意义和应用K m的意义a)K m是酶的特征性常数之一；b)K m可近似表示酶对底物的亲和力；c)同一酶对于不同底物有不同的Km值。 （三）m m值的测定1.双倒数作图法(double reciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法-1/K m1/V max1/S1/V V maxSK m+SV=（林贝氏方程）+1/V=K mV max1/V max1/S两边同取倒数2.Hanes作图法SS/V-K mK m/Vm在林贝氏方程基础上，两边同乘SS/V=K m/V max+S/V maxxx年硕士研究生入学考试西医综合科目试题一个简单的酶促反应，当SK m时，出现的现象是A.反应速度最大B.反应速度太慢难以测定C.反应速度与底物浓度成正比D.增加底物浓度反应速度不变E.增加底物浓度反应速度降低血糖浓度低时，脑仍能摄取葡萄糖而肝不能是因为A.脑细胞膜葡萄糖载体易将葡萄糖转运入细胞B.脑己糖激酶的Km值低C.肝葡萄糖激酶的Km值低D.葡萄糖激酶具有特异性E.血脑屏障在血糖低时不起作用pH对V的关系曲线V0714pH 二、pH对反应速度的影响 二、pH对反应速度的影响?最适pH(optimum pH)酶催化活性最大时的环境pH0酶酶活活性性pH pH对某些酶活性的影响胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶246810应用最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类与浓度、以及酶的纯度等因素的影响。 除少数例外，体内多数酶的最适pH接近中性。 pH影响酶蛋白、辅酶及底物的解离，最终影响酶蛋白与辅酶的结合及酶与底物的结合。 过高、过低的pH导致酶蛋白变性。 ?双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。 三、温度对反应速度的影响?最适温度(optimum temperature)酶促反应速度最快时的环境温度。 酶酶活活性性0.51.02.01.50102030405060温度?C温度对淀粉酶活性的影响温度对V影响的表现（ （1）温度较低时，V随温度升高而增大。 （ （2）使酶促反应V达到最大时的反应温度称为酶的最适温度（不是酶的特征性常数）。 (3)反应温度达到或超过最适温度后,随着反应温度的升高,V下降。 *低温的应用一般的酶在低温下活性降低，但酶本身不被破坏，其活性可随温度的回升而恢复。 四、酶浓度对反应速度的影响?当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 ?关系式为V=K3E0VE当当SE时，V max=k3E酶浓度对反应速度的影响酶的激活剂（activator）使酶从无活性变为有活性或使酶活性增加的物质必需激活剂（essential activator）为酶促反应所必需，如缺乏则测不到酶的活性。 Mg2+为己糖激酶的必需激活剂非必需激活剂（non-essential activator）可以提高酶的催化活性，但不是必需的。 Cl-对唾液淀粉酶的激活作用 五、激活剂对反应速度的影响 六、抑制剂对反应速度的影响?酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。 ?区别于酶的变性?抑制剂对酶有一定选择性?引起变性的因素对酶没有选择性抑制作用分类不可逆抑制可逆性抑制非专一性如巯基酶的抑制专一性如:羟基酶的抑制竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制 (一)不可逆性抑制作用*概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。 不能用透析、超滤等方法去除抑制剂使酶恢复活性。 11.非专一性不可逆抑制重金属离子及砷化合物?巯基酶解毒-二巯基丙醇(BAL)ESSAsCHCHCl+CH2SHCHSHCH2OHESHSH+CH2SCHSCH2OHAsCHCHCl失活的酶BAL巯基酶BAL与砷剂结合物ClAsClCH CHCl+ESHSHESAsSCH CHCl+2HCl路易士气巯基酶失活的酶酸ROROPOX+HO EROROPOO E+HX有机磷化合物羟基酶失活的酶酸E-O-P+解磷定E-OH解磷定+P解救方法加入解磷定（PAM）2.专一性不可逆抑制胆碱酯酶（羟基酶）作用:乙酰胆碱乙酸+胆碱胆碱酯酶乙酰胆碱是神经递质，当胆碱酯酶失活，乙酰胆碱在体内堆积，引起胆碱能神经兴奋性增强的中毒症状。 （二）可逆性抑制作用*概念抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。 竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制*类型.竞争性抑制作用+I EIE+S E+P ES反应模式定义抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。 这种抑制作用称为竞争性抑制作用。 Competitive inhibition+E E S IES EIE P*特点 22、抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度； 1、I与S结构类似，竞争酶的活性中心； 3、动力学特点V max不变，表观K m增大。 抑制剂无抑制剂1/V1/S*举例?丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶C OO HC H2C H2C OO HC OO HC OO HCH2丙二酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶FAD FADH2延胡索酸?磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶对氨基苯甲酸谷氨酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸COOH H2N SO2NHR H2N磺胺类药物四氢叶酸核酸2.非竞争性抑制*反应模式E+S ESE+P+SS+SS+ESI EIE ESE P+I EI+S EIS+I nonpetitiveinhibition*特点)a)抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；)b)抑制程度取决于抑制剂的浓度；c)动力学特点V max降低，表观K m不变。 抑制剂1/V1/S无抑制剂.反竞争性抑制*反应模式E+SE+P ES+I ESI+ESES ESIE P*特点)a)抑制剂只与酶底物复合物结合；)b)抑制程度取决于抑制剂的浓度及底物的浓度；c)动力学特点V max降低，表观K m降低。 抑制剂1/V1/S无抑制剂各种可逆性抑制作用的比较动力学参数表观Km K m增大不变减小最大速度V max不变降低降低林-贝氏作图斜率K m/V max增大增大不变纵轴截距1/V max不变增大增大横轴截距-1/Km增大不变减小与I结合的组分E E、ES ES作用特征无抑制剂竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制第五节酶的分离、提纯及活性测定1选材选择含酶最丰富的材料2破碎细胞细胞外酶用水或缓冲液浸泡，得粗抽提液细胞内酶研磨（动物细胞）等超声波（细菌细胞）等 一、酶的分离、提纯3抽提用稀盐、稀酸、稀碱溶液；在合适的pH范围内，远离pI，温度04；4去核酸、去多糖鱼精蛋白或氯化锰去除核酸，醋酸铅去除粘多糖；5纯化去除杂蛋白，利用溶解度，分子大小，电荷性质等的不同，进行分离纯化；6保存由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意:1全部操作在低温04。 2在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量-巯基乙醇。 4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。 酶的纯度用比活力表示比活力=活力单位毫克蛋白总活力酶的活性是指酶催化化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度。 酶促反应速度可在适宜的反应条件下，用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。 二、酶的活力测定用酶活力测定来定性、定量的原因酶蛋白含量低；与多种蛋白混杂，提纯困难，难以直接定量。 酶活力测定更能反映酶的功能状态。 酶的活力单位在最适条件下，单位时间内酶催化底物的减少量或产物生成量。 1961年国际酶学会议规定1个酶活力的国际单位（IU）=特定条件下，一分钟内生成1微摩尔产物的酶量。 (1mol/min)1972年国际酶学委员会又推荐催量(Katal,Kat)单位:1个Katal=最适条件下，每秒钟催化1摩尔底物的酶量。 (1mol/sec)1Kat=6?107IU酶活力的习惯单位 一、寡聚酶由两个或两个以上，乃至多达数十个亚基组成的酶称为寡聚酶。 其分子量从35000到几百万，可分为几种不同的类型11含相同亚基的寡聚酶22含不同亚基的寡聚酶第六节重要的酶类1.含相同亚基的寡聚酶?目前，带倾向性的认为单体酶（仅含一条肽链，如一些蛋白水解酶、核糖核酸酶等）比较少见，而更普遍的是以寡聚酶的形式存在。 例如，在糖酵解（糖的无氧分解代谢）中的许多酶都是寡聚酶，各有不同数目的亚基。 2.含不同亚基的寡聚酶?双功能寡聚酶?具有底物载体亚基的寡聚酶 （1）双功能寡聚酶?有的寡聚酶所含的亚基结构不同，每种亚基表现不同的功能，因而整个酶分子催化两个相关的反应，这种寡聚酶称为双功能寡聚酶。 （2）具有底物载体亚基的寡聚酶在某些寡聚酶中，亚基作为底物载体而起作用。 这种寡聚酶可以看作是由具有酶活性的蛋白部分和作为底物载体的蛋白部分组成。 3.寡聚酶的意义?亚基之间互相配合，完成功能；?通过亚基之间的聚合与解聚进行活性调节。 二、同工酶(Isoenzyme)一概念能催化相同的化学反应，但酶的分子结构、理化性质、免疫学性质乃至生物学功能有所不同的一组酶。 二分布同工酶可以存在于同一机体的不同组织中，亦存在于同一细胞的不同亚细胞结构中。 ?同工酶是基因分化的产物。 ?同工不同功。 ?不同的同工酶其专一性、与底物亲和力及动力学不同。 *举例乳酸脱氢酶(LDH1LDH5)NAD+NADH+H+OH CH3-CH-COOH CH3-CO-COOH乳酸LDH丙酮酸每个酶分子有四个亚基；亚基有两种心脏亚基（H）；肌肉亚基（M）H H H H HHH MHH M MHM M M MMMMLDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)乳酸脱氢酶的同工酶乳酸丙酮酸LDH5骨骼肌:乳酸丙酮酸心肌:LDH1人体各组织器官中LDH同工酶的分布同工酶百分比组织器官LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5心肌6729411肾肾52281641肝肝24112756骨骼肌47212741红细胞42361552肺肺1020302515胰腺301550-5脾脾102540255子宫52544224*生理及临床意义在代谢调节上起着重要的作用；用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征；同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。 心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化11酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱肝病酶谱22334455 三、诱导酶?诱导酶（induced enzyme）当细胞中加入特定诱导物质而诱导产生的酶。 ?诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。 ?例如大肠杆菌利用乳糖共价修饰调节变构调节?调节方式?调节对象关键酶 四四、调节酶限速反应、限速酶与关键酶概念在多酶体系催化的代谢途径中，各步酶促反应的速度不一样。 其中，反应速度最慢，决定着整个代谢途径速率的少数 一、二步反应，称为限速反应。 催化限速反应的酶称为限速酶。 限速酶是催化单向反应的酶，其活力大小决定了代谢途径的速率乃至代谢方向，故又称为关键酶。 限速酶（关键酶）的特点控制整个代谢途径的速率与方向。 往往在代谢途径的起始反应或分叉点起作用。 多受代谢途径终产物的反馈抑制。 （一）酶的共价修饰调节?共价修饰(covalent modification)在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。 ?常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化SH与SSSS互变酶的磷酸化与脱磷酸化-OH Thr Ser Tyr酶蛋白H2O Pi磷蛋白磷酸酶ATP ADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白（二）变构酶?变构效应剂(allosteric effector)变构激活剂变构抑制剂?变构调节(allosteric regulation)?变构酶(allosteric enzyme)?变构部位(allosteric site)代谢物可与酶分子活性中心外的部位（变构中心）可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。 变构酶常为多个亚基构成的寡聚体，具有协同效应变构激活变构抑制变构酶的形曲线SV无变构效应剂?变构调节的机制变构酶催化亚基调节亚基变构效应剂底物、终产物其他小分子代