藻种培养方法.doc

藻种培养方法一、藻种的两种培养类型一般来说藻种的培养有两种方式：一种是长期保存所需要的培养方法，一种是以实验为目的，短期内保藏藻种的培养方法。长期培养最主要的问题是选择一种合适的培养基，可以在3个月到一年的时间内连续培养藻种。最适合长期培养藻种的培养基是agar（固体琼脂培养基），但是使用agar有一个弊端，即培养物保持无菌的问题；我们可以加一层蒸馏水（咸水的藻类可以加灭菌过人工的海水）在agar上，这种做法可以保证在长期保种的过程中减少agar水分和营养的流失。长期保种使用的培养基，不要选择营养过于丰富的，因为多数的藻，尤其是丝状藻，在营养丰富的环境生长，会发生形态结构上的变化，如果要做生理生态方面研究，实验材料的形态结构是不能异常的。适合长期保种的贫营养的培养基有这些：Bolds基础培养基，以及该培养基加上蛋白胨或者琼脂制成的agar，适合长期培养绿藻；Allen及其改良后的配方可以长期培养一般常见的蓝藻和绿藻；土水培养基和它的一个改良的系列也实用培养多数藻种。对于我库提供的藻种，由于藻种长期习惯的原因，建议使用我们提供的原配方来培养，在长期培养的时候，可以适当稀释原培养基，在藻种培养过程中，生长速率会变慢，可以保持其形态结构不变。另外，长期培养的时候，除了选择适当的培养基，还可以降低温度58C（降温的过程最好能循序渐进，突然改变环境温度，可能会导致藻种不适应而死亡）。光照强度可以减小为原先的一半。在实验之前3到4周，将长期培养的藻种接种到我们提供的培养基中（培养基必须灭菌），按照我们给予的培养条件培养，在实验前6天左右，再次接种。短期培养则可以直接按照我们提供的培养基和培养条件培养。由于试验的需要，常常要求在短期时间内获得大量的培养物，我们可以采用通气培养和摇床培养。通气培养可以通CO2或洁净的空气，视培养物的多少来决定通气泵的大小，在通气的硅胶管中设置一个缓冲瓶，塞上灭菌后的脱脂棉，帮助净化空气，如果对通气有更高的要求，可以在通气管中加上一层滤膜。使用摇床培养，需要注意藻种的生理周期。 二、培养基的选择和配制1、培养基的选择BG11是我库培养蓝藻使用最广泛的培养基。除了极少部分蓝藻，大部分都使用BG11。按照我们给的配方配制好后高压灭菌，BG11经常会产生絮状沉淀。这是因为其中有Ca+和CO32-,我们可以在灭菌后再超净台上用灭菌过的注射器来加两者之中的另外一种。通常我们建议将氯化钙的母液单独灭菌后在无菌室保存，在配置好BG11的工作液并灭菌之后，在超净台上用注射器将氯华钙加入。SE是我库用来培养常见的绿藻所使用的培养基。一般来说，如果配制了母液，用母液来配培养基，灭菌后是不会产生沉淀的。配置的时候注意先将所需要的蒸馏水准备好，将需要的药品逐个加入，等到一种药品充分溶解之后再加入第二种。另外，土水在蒸馏过滤后，是不需要灭菌的，因为高压灭菌的过程会让其中的一些营养成分损失。水是培养基成分中很重要的一个方面。配培养基，可以取蒸馏水、自来水、去离子水，也可以取藻种采集地的水。使用经过处理的水，如双蒸水、去离子水，有时候并不合适培养，因为仪器在处理过程中会带入微量的有毒物质。采集藻种采集地的水来培养是最理想的，但是需要经过一些处理，处理的手段和过程要尽可能保持其营养成分不变。如果是咸水或者海水的藻类采集地采集的水，应将其置于5的黑暗中，保持6个月。如果是泉水或者湖水等淡水的水源，水样置于20的室温，立即通过活性炭方法处理：每升水加2g活性炭，搅拌一小时后，过滤，并重复此过程34次。咸水和微咸水的藻类需要的人工咸水的合成效果关键在于如何蒸馏；还有一些水华蓝藻难以培养，主要原因是因为在野外生长时，通常底泥提供的营养元素可以溶在水中，但是在实验室培养，经过高压灭菌，很多营养都损失了。所以我们建议不用高压灭菌法，使用巴斯德（pasteur）灭菌方法：加热到7378，保持1520分钟，间隔24小时灭菌一次，一共三次。2、培养基的配制主要介绍一下培养基的配制方法和灭菌方法：1.配制贮液。培养基一般由三个方面组成：微量元素、大量元素、维生素。准备100ml200ml的试剂瓶若干，洗净，灭菌。按照我们提供的培养基配方中贮液的浓度，配制大量元素和微量元素的贮液放在以上准备的试剂瓶（遇光易反应的药品，请放在棕色试剂瓶），置于4左右的冰箱保存。将需要使用的维生素（最好是针剂），也置于4左右的冰箱保存。2.配制培养基。一般可以配制1000ml左右的培养基留待使用。先准备1000ml大烧杯，洗净。按照我们培养基配方中的workingsolution，先加入需要的蒸馏水，然后用移液管向其中加配制好的贮液（注意，不可先加贮液，最后加蒸馏水）。一边加，一边搅拌，依次加入所有组分，最后留下维生素不加。摇匀。三、灭菌、对培养器材的灭菌：灭菌在藻种的培养中，是十分重要的一个环节。藻种培养、转接、培养基制备等等，任何一个环节都必须使用灭菌的器械，否则藻种都会染菌，甚至染上其它的藻类。所有的培养藻种所需要的三角瓶、试管，烧杯，接种环，吸管，注射器，针头等培养，转接藻种所需要的器材都必须经过高压灭菌，配制培养基所需要的移液管、用来装培养基所需要的瓶也必须经过灭菌，转接藻种需要的滴管、接种环、涂布所需要的玻璃棒、培养皿等都必须灭菌。培养所需要的三角瓶、试管、培养皿，灭菌前洗净，三角瓶可以用牛皮纸内衬粗滤纸来包住瓶口，用棉线缠紧；或者自做棉塞，外部再加上牛皮纸包住；试管必须和棉塞或者试管塞一起用牛皮纸包好灭菌。培养皿可以510个一起用牛皮纸包好灭菌。移液管、滴管、接种环都可以分别用牛皮纸包好灭菌。所有玻璃器皿都采用高压灭菌：在1.5大气压下保持30分钟。使用之前不能在敞开的环境打开，只能在超净台打开。灭菌结束后，放在烤箱烘干。所有灭菌后的器皿、培养基只能在超净台打开使用。使用巴斯德灭菌法灭菌的原水，也不能在超净台之外的地方打开使用。长期没有使用了但曾经灭菌过的器材或培养基，如果需要使用，必须重新灭菌一次。、培养基灭菌注意事项：配制培养基的时候一些经过高压灭菌成分会发生改变的微量元素，应在灭菌后在超净台上用灭菌的注射器添加。如维生素，但是维生素的灭菌也必须很严格，往往藻种污染到细菌都是因为维生素引起的，可以使用0.22m或0.45m的滤膜来过滤维生素溶液。土水（土壤侵出液）在蒸馏过后只能使用过滤的方法灭菌，不能经过高温高压灭菌。洗净若干带橡皮塞的盐水瓶（800ml或500ml），将培养基注入，塞上橡皮塞。然后剪一小块纱布，包在橡皮塞外面，用棉线将塞子和瓶子缠紧，这样保证在灭菌的过程中，培养基不会把橡皮塞冲开。最后在橡皮塞头上插一个小针头，这个做法可以在灭菌的时候放气，也是为了保证培养基不会在灭菌的时候把橡皮塞冲开。然后开始灭菌。灭菌结束后，立即降针头拔出。将培养基放置在洁净的地方，免受污染。四、藻种培养条件1、光照培养一个藻种最初，先将少量的藻种转接到新鲜的培养基中，放在冷白荧光灯管（200400footcandle）保持710天，观察最初的生长状况。生长较好以后，移到低光照区域（50100footcandle），保持低速率的生长。实验需要的藻种的培养中，我们推荐使用冷白荧光管来作为光照来源。因为如果使用白炽灯泡和直射的日光作为光源的话，光照会产热，改变培养的温度。在阳光照射下培养温度通常可以上升10，如果一定需要日光作为光源，应将培养物放置在窗前，窗上用纸挡住。培养的时候，光照与培养物的细胞密度也有关，一般密度比较小的时候，不适合使用较强烈的光照。我库提供的藻种，在细胞密度在105数量级左右时，我们推荐在2000lux的光照下培养。接种后，细胞密度很低的情况下，需要放置在弱光照下培养，随着细胞密度增大，逐渐加强光照。培养藻类，每天要定期给一段时间的置于黑暗中培养。大多数藻种的光暗比都是12h：12h，也有16h：8h。2、温度大多数淡水藻都可以在2025左右生长，高于30有些蓝藻不能坚持到24小时就会死亡。一般所有的绿藻生长的温度相对比较广一些。在10左右会几乎停止生长，但是不会死亡。非水华类的蓝藻更加可以耐低温的环境，低于10还可以生存。但是水华类的蓝藻对温度要求更加精确一些，过高或者过低的温度都会死亡，即使留下待萌发的孢子，但是在实验室不具有底泥萌发的条件，藻种是不会再萌发出来的。我库的大部分藻种，没有特别说明，其培养温度都是2025。3、特殊藻种培养要求衣藻如果在营养丰富的培养基中生长，都会有变成类似四集藻型的趋势。所以建议培养的时候稀释一下SE培养基，或者用土水培养基来保持它的形态结构。团藻属的藻类需要勤接种，使用营养太丰富的培养基，它可能会由群体散开成为单个游动的细胞。培养含有叶绿素的鞭毛藻，可以用土水培养基加上一粒豌豆；无色的鞭毛藻，可以用土水培养基加上一两粒谷粒或者小麦。硅藻可以使用很多种培养基来培养，但是培养基中必须含有硅，建议硅藻的培养基中Na2SiO3.9H2O达到1030mg/l。藻种的采集、分离技术浮游藻类定性样品可以用浮游生物网25#网采集，在自然水体中采集藻类的时候，如果为了分离和检验藻类生活水体的相关指标，通常还需要采集自然水体作分析用。浮游藻类定量样品用采水器采集1升水，装瓶加入510ml鲁哥氏液固定，并贴上标签，并需要记录水体pH值，气温和水温，地点和日期附着生长的藻类和丝状藻类可以从碎石，碎叶或者其它一些可能供藻类着附生长的植物上刮下采集，装瓶。采集到的活体样品，应在短期内观察，分离；很多种类，尤其是鞭毛类的藻会在很短的时间内死亡。 要确定所培养的藻种是一个纯的品系，必须从样品中分离出单克隆。一个纯的藻的单克隆必须是由一个单细胞繁殖而来。丝状藻的纯品系，必须来自一根丝体上的几个连续的细胞。介绍几种分离的技术：1毛细管清洗技术选择直径为34mm的软玻璃管，或者其它任何适合拉成毛细管的巴氏滴管，用镊子夹住滴管的前端，放在酒精喷灯的外焰上，直到玻璃变软，迅速移离火焰，同时快速拉成毛细管。由于拉的时候的力度和掌握时机的不同，毛细管的口径会有不同，所以经常练习，达到熟练，可以将毛细管拉成自己需要的口径，即刚刚适合要挑取的藻细胞进入的大小。然后用镊子把毛细管头端夹断，注意夹断的时候的用力均匀，尽量要保证毛细管口平滑，避免成为锯齿状边缘。在管的另一段加上胶吸头或者软的橡皮管。用滴管吸取少量采集样品滴在灭菌后的点滴板上的凹陷上，置于解剖镜下观察。如果样品中藻细胞浓度很大，种类繁多，可以将样品用蒸馏水或者培养基稀释。然后在至少612个凹陷上滴入蒸馏水和培养基。在解剖镜下观察，移动毛细管的细管头在需要挑取的细胞上，小心进入液体中，迅速挑取，将细胞排放在另一个装有蒸馏水或者培养基的凹陷里。用以上方法挑取1215个单细胞，然后在装有蒸馏水或者培养基的凹陷中清洗612次，每清洗一次，必须重新拉一次毛细管。经过有效的清洗，将最后得到的单细胞放在8个装满培养基的灭菌过的小试管中，放在适合被挑取藻生长的光照条件和温度条件下，开始培养，36周后即可以镜检看是否生长了。用毛细管分离的方法分离丝状藻类，按照以上所述的方法拉一根毛细管，前端带上一小钩，小心勾住藻样中的一根单丝体，分离出来，在点滴板的凹陷清洗612次。清洗结束后，取一含0.50.75低浓度的agar平板，将清洗后的藻丝体在平板上拖动几次，除去丝体表面的一些体表寄生菌。2喷雾技术1964年，Wiedemanl.建立了一种相对简单的技术，既可以分离，也可以用来纯化。首先灭菌一批15ml的离心管，取89ml藻样放入离心管，调节转速2000rpm，离心4590秒，去除上清液，然后加入蒸馏水或者灭菌后的培养基，重复以上操作12次左右。经过最后清洗，倒去2ml上清液。取15cm长的小滴管拉成毛细管（毛细部分长度需略长于离心管），将该毛细管夹断，使毛细部分略长于离心管，插入到离心管底部，离心管口用棉花塞住，毛细管留出一部分在棉花之上。将离心管直立固定在铁架台，将压缩空气通过一灭菌过的滴管放出，喷在毛细管头部，这把从离心管底部通过毛细管出来的藻细胞均匀吹出，在距离离心管25cm处放置一个灭菌过的agar培养皿，这样经压缩空气喷出的藻细胞就到达平板上。喷雾结束后，将agar用parafilm膜密封好，置于适当培养条件下培养，几天后，单细胞的藻，或者单藻落长出来，可以在无菌的条件下用毛细管挑出来，放入灭菌后的液体培养基培养。3其它技术这里介绍几种其它的分离技术。倒平板法：制作营养成分相对较少的固体培养基，灭菌后冷却，当培养基已经变凉但还未凝固的时候，取少量采集样品，与之混合，搅拌，倒在灭菌后的培养皿上，等它凝固，密封培养。培养一周左右，将生长出来的单克隆从原培养基上割下来，放入新鲜的培养基继续培养。划平板法：当藻单元的直径小于10m时，最容易的分离方法就是划平板或涂平板法。这两者中的任何一种分离方法，都可能得到无菌的培养物。准备一个装有用琼脂（1-1.5%）固化的培养基的培养皿，滴1-2滴自然采集物于琼脂的边缘。用火焰灭菌一个线环，或者一弯玻璃棒（将棒浸入70%酒精溶液，放在火焰上点燃并移离火焰；重复几次。）使用无菌的线环或玻棒，在无菌条件下将滴在琼脂上的自然采集物滴平行划在琼脂表面上。如有需要，可用蜡笔（记号笔）在培养皿的外底部划线标记，在合适条件下培养4-8天，然后在显微镜的高倍镜下观察，检查该样品是否为单藻株。将挑得的单克隆利用上述方法再划平板，让其再长出新的藻落。第二次划平板可以减少细菌污染藻落的可能性，也使各藻落更趋于来自同一藻单元。最后，从目的藻落挑取藻单元到液体或琼脂培养基。涂平板法：该方法与划平板法相似，只是它是将藻单元涂抹在琼脂培养基的表面，而不是用线环划线。准备一个培养皿，用巴斯德吸管吸一滴自然采集物，将其固定在桌子上，细端离开桌面向上倾斜。在其粗端套上气泵，使在其细端产生较高压力的空气流。一手持有琼脂培养基的培养皿，使培养的琼脂表面与产生气流的细管垂直，距离约200mm。一手持吸有自然采集物的巴斯德吸管，对准高速空气流挤出采集物液滴，使在高速空气流下产生的水雾均匀喷洒在琼脂培养基表面，密封培养。培养一周左右，在显微镜的高倍镜下观察，检查该样品是否为单藻株，将挑得的单克隆转移到液体或琼脂培养基。5、为：柠檬酸和柠檬酸铁铵6、EDTA：乙二胺四乙酸BG-11 StockFinalNaNO31.5g 1.5g/LCaCl2 18g/500ml 1ml/L36mg/LNa2CO3 10/500ml 1ml/L20mg/LMgSO4.7H2O 37.5g/500ml 1ml/L75mg/LK2HPO4 15.25g/500ml 1ml/L