酶与蛋白质复习参考.doc

1.酶对生命的作用酶可以说是一切生命活动的序幕，酶决定机体的化学变化。在活细胞中进行着大量化学反应这些化学反应的特点是速度非常高，并且能有条不紊地进行，从而使得细胞同时能进行各种降解代谢及合成代谢，以满足生命活动的需要。生物细胞之所以能在常温常压下以极高的速度和很高的专一性进行化学反应，是由于其中存在着生物催化剂酶。酶促反应要比相应的没有催化剂的反应快1031017倍。2. 酶及生物催化剂的概念传统的酶的观念是：酶是活细胞产生的，以蛋白质为主要成分的生物催化剂。现在人们对于ribozyme、抗体酶、探针酶、克隆酶、突变酶、人工酶以及模拟酶的研究发现，它们除了在功能上与传统的酶极其相似之外，在外源和化学本质方面，不同于传统酶，且各有特点。Ribozyme虽来源于生物体，但它们的化学本质是RNA。抗体酶、探针酶、克隆酶都是生物体产生的蛋白质属性的酶，但是它们的产生离不开人工免疫的过程、人为的基因克隆以及基因定位突变技术等。人工酶虽然是具有催化活性的多肽或蛋白质，但是它的产完全依赖于体外的人工合成法。模拟酶是人工合成的既非蛋白质又非RNA的物质。酶是生物催化剂，酶的化学本质是蛋白质的传统观念受到挑战。有学者提出由于人为加工而产生的酶例如抗体酶、探针酶、克隆酶、突变酶、人工酶等可以作为酶的“亚种”，可以取用新名词，仍然归属于生物催化剂这一范畴，而不必更改已有的酶定义。模拟酶既非蛋白又非RNA的物质，可以称为模拟生物酶。3. 酶学研究重大进展（1）新酶的发现和鉴定：迄今为止，已发现逾25000种，大约有数千种酶被鉴定，数百种酶得到了结晶，数百种酶的一级结构被测出来了。（2）酶一级结构与活力的关系采用新技术和新方法研究酶结构和功能的关系。（3）酶分子高级结构的测定对酶分子高级结构的测定，目前X射线衍射法仍然是十分有效的方法。近年来核磁共振技术的应用也越来越广泛。（4）酶活性部位结构及催化机理的研究: 这是酶学研究最核心的问题之一。（5）酶的调节作用: 酶反应速度快慢的调控，各反应环节的相互制约和调节，主要是别构酶的研究。4.酶分离纯化 (1)建立一个可靠快速的测活方法 可靠性表现在专一、灵敏、精确、简便测活方法是否经济测活方法越简单，纯化所需等待时间越短，失活越少一个好的测活方法的建立，就是整个纯化工作成功的一半。酶原料的选择(2)酶的提取生物材料的破碎：机械（匀浆）法 超声波法 冻融法 渗透压法 酶消化法(3)酶的提纯根据酶分子大小、形状不同的分离方法：离心分离、凝胶过滤、透析、超滤 根据酶分子电荷性质的分离方法：离子交换层析、层析聚焦法、电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳 根据酶分子专一性结合的分离方法：亲和层析 、免疫吸附层析、染料配体亲和层析、共价层析(4)酶纯化方法选择的一般原则：酶纯度的鉴定、超速离心、电泳、SDS电泳、等电聚焦、N末端分析、免疫技术。5.酶活力 酶活力（enzyme activity)：酶催化某一反应的能力V V单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量测定方法：终点法（化学反应法） 动力学法：分光光度法 荧光法 酶偶联测定法 电化学法：微电子电位法 电流法 电量法 极谱法注意事项：严格控制实验条件，最适温度、最适pH ES 做对照实验 酶液不宜放置过久 有些反应不一定在水溶液中进行 6酶的催化机理及研究方法机理：催化本质降低反应的活化能 (1)邻近定向 (2)扭曲变形和构象变化的催化效应(变形与张力) (3)酸碱催化 (4)金属离子催化(相当于酸催化) 比酸催化强 (5)共价催化(亲核亲电催化) (6)微环境的影响研究方法：1 X衍射 2 化学修饰法:(1)专一性氨基酸共价修饰法 (2)差别修饰法（差别标记）(3)亲和标记法 3 动力学分析 4定位诱变法7影响酶促反应速度的因素（1）浓度因素：酶浓度 底物浓度 效应物浓度（2）外部因素：温度 压力 介电常数 离子强度 pH（3）内部因素：S及效应物的结构 酶的结构8抑制剂的概念及研究意义抑制作用：酶分子上的必需基团与某种化学物质相结合而引起酶活性丧失或降低，称之为抑制作用。能引起抑制作用的物质称为抑制剂。造成酶活力下降 酶-蛋白质变性 去激活作用 抑制作用必需基团性质改变研究意义：研究酶的抑制剂及其抑制作用，在生物学、医学和农业生产上有着十分重要的意义。理论上，研究酶抑制剂及其抑制作用，有助干阐明酶活性中心结构、催化机理、代谢途径以及代谢调节，有助于阐明药物和毒物作用机理，实践上，可以为治疗人类和畜禽疾病设计疗效更高的抗茵、抗病毒药物，为消灭农作物病虫害设计更有效的杀虫剂和杀菌剂，为解除毒物对人、畜的中毒而设计快速、有效的解毒药物。9多底物反应动力学多S反应的类型: (1)序列有序反应 需要NAD+（NADP+）的脱氢酶属这种类型 辅酶象底物一样起作用(2)序列随机反应 糖原磷酸化酶 (3) 乒乓反应 1.氨基酸个性研究的重要性解释蛋白质结构与功能的关系，从一级结构预测高级结构；氨基酸个性了解得越深刻，在根据一级结构预测蛋白质的立体结构时，考虑问题也就越全面，预测的正确性也就越高。2.维持空间构象的因素 静电作用、氢键、范德华力、疏水作用、配位键、二硫键及其他因素3.蛋白质的时空特性研究蛋白质的结构和功能，离不开Pr结构层次。如果要进一步了解蛋白质在生命现象中所处的地位，只将着眼点放在个别Pr的结构与功能是不够的。即使观察Pr在一些体系中的作用依然不够，而是要了解Pr在何时、何处起何种作用，即研究Pr的时间和空间特性。从某种意义上来说，对蛋白质的时空性质的研究已经超出了蛋白质结构生物学的范畴，要从细胞生物学、发育生物学，乃至生理学的角度来研究Pr或Pr体系的产生和定位。 1.蛋白质的空间性：信号肽对蛋白质或肽链的定向传送已成为蛋白质研究的一个很重要的方面。2.蛋白质的时间性：细胞周期不同时期蛋白质表达的调控是又一个重要研究领域。4.分离纯化依据的性质 大小、形状、电荷、等电点、电荷分布、疏水性、溶解度、密度、配体结合能力、金属结合能力、可逆性缔合、特异性序列或结构、非寻常性质、基因工程构建的纯化标记5.分离纯化的一般步骤（一）前处理 (1)选材 (2)破碎 (3)混合物的分离：（二）粗分级（1）盐析（2）等电点沉淀（3）有机溶剂分级分离（4）超滤（5）凝胶过滤（6)冷冻干燥（三）细分级 一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。6.依据分子大小、电荷不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超滤透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。超滤：除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质 2.密度梯度离心生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。3.凝胶层析又叫分子筛层析 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。根据电荷不同的纯化方法1.聚丙烯酰胺凝胶电泳 毛细管电泳2.等电聚焦 在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体，当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：高效率分离纯化蛋白质；测定蛋白质pH3.层析聚焦 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。4.离子交换层析7.结构与功能的关系蛋白质一级结构：指多肽链上各种氨基酸的排列顺序及二硫键的位置。细胞色素镰刀型细胞贫血症：由于患者的血红蛋白与正常人的血红蛋白的一个亚基的一级结构一个氨基酸发生了替换，由原来的谷氨酸替换成了缬氨酸造成的。分子病：由于基因突变导致蛋白质一级结构发生变异，使蛋白质的生物学功能减退或丧失，甚至造成生理功能的变化而引起的疾病。血红蛋白（Hb）：有四条连组成，是一种比肌红蛋白复杂的多的蛋白。由于血红蛋白亚基之间存在大量离子键，使其构象呈紧张态，对氧的亲和力很低，第一个亚基与O2结合时，离子键的破坏较难，所需要的能量较多。当血红蛋白的一个亚基结合氧之后引起它的构象从紧张态（T）变成松弛态（R），其它的离子键也依次破坏，此时破坏离子键所需要的能量也少，构象的变化导致血红蛋白对氧的亲和力大大增强，因此第四个亚基结合氧的能力比第一个大几百倍。 上述Hb与O2结合后，Hb的构象发生变化，这类变化称为变构效应，即通过构象变化影响蛋白质的功能。像血红蛋白这种具有变构效应的蛋白质称为变构蛋白。血红蛋白的这种变构效应能更有效地行使其运氧的生物学功能。肌红蛋白：是由氨基酸残基组成的单肽链，其三级结构就是分子本身的构象，在肌肉中Mb负责存储氧气的作用，在高氧气分压下Mb与Hb结合相同数量的氧气，但在低氧气分压下血红蛋白更易放出氧气，这与二者的高级构象的不同有很大联系。8. 变性蛋白的表现:生物活性的丧失 侧链基团的暴露 物理化学性质的改变: 溶解度.分子形状. 粘度等. 化学性质的改变 变性后的蛋白质肽链松散，内部侧链基团暴露，易于与有关显色试剂接触，使颜色反应增强。生物化学性质的改变:易被蛋白酶水解变性机理温度：温度升高，使分子内振动增强，破坏维系空间结构的次级键的作用（主要是氢键），使蛋白质变性。酸、碱：主要是由于解离基团质子得失后，生成过多正或负电荷，使肽链间静电斥力增加的结果。有机溶剂A. 由于有较低的介电常数，常使肽链内静电斥力增加，造成蛋白质分子膨化或松散；B. 在极性较低的有机溶剂环境中，疏水基团易于从内部向外部转移，使疏水作用力削弱，促进蛋白质的变性。重金属盐 重金属盐有可能和蛋白质的极性基团直接作用，使稳定性发生变化，也可能通过改变溶剂的结构间接影响蛋白质的结构。鉴定蛋白质变性的方法测定蛋白质的比活性测定蛋白质物理化学性质的变化测定蛋白质生物化学性质的变化用免疫法测定蛋白质的抗原性是不是改变蛋白质的溶解度是不是下降。9.亚基与原体亚基一般只是一条多肽链，但有的亚基由二条或多条肽链组成，这些多肽链之间以SS相连。 对称的寡聚蛋白质可视为两个或多个不对称的相同结构成分组成，这种相同结构成分称为原体。在同多聚体中原体是亚基，但在杂聚体中原体是两种或多种不同的亚基组成。10氨基酸的性质和密码子的关系（1）氨基酸性质与密码子的组成及序列有一定关系：不同种类的氨基酸有其各自不同的密码子数量（2）氨基酸性质与密码子的关系第二个字母为U的密码子对应的是疏水性氨基酸第二个字母为C的密码子对应的是小或较小氨基酸第二个字母为A或G的密码子对应的是极性氨基酸11.蛋白质组学研究的内容和研究方法蛋白质组：对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组学：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 主要研究内容 ：了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类； 明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的； 描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与底物结合并且决定其活性的部位。 功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。12.研究蛋白质相互作用的常用的方法酵母双杂交、亲和层析、免疫共沉淀、蛋白质交联、基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法、噬菌体显示系统筛选人工酶：人工合成的具有催化活性的蛋白质或多肽。模拟酶：利用有机化学合成的一些比酶结构简单得多具有催化功能的非蛋白质分子。克隆酶：用基因工程技术生产的酶突变酶：用基因定位突变技术修饰天然酶基因，然后用基因工程技术生产该突变基因的酶，被称为突变酶酶活力：酶催化某一反应的能力酶活力单位：特定条件下，1min内，能转化1mol底物所需要的酶量比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数（U/mg蛋白）米氏常数意义（1）活性中心被S占据一半时的S（2）特征常数 取决于酶的性质，与E无关,但与 T 和 pH有关 (3) Km可近似表示E与S的亲和力 1/Km 与亲和力近似成正比(4) 一种酶可有几种S，其中Km最小的S，为最适S (5) 已知Km，可根据 S v ; vS(6)了解酶的Km及S在细胞内浓度推知是否受S调节（7）催化可逆反应的酶，测Km和S推测催化方向（8）在连锁反应中根据Km找出限速步骤（9）用于鉴别原级同工酶，次级同工酶（10）测定不同抑制剂对某个酶的Km、Vm的影响判断抑制类型抑制剂：能引起抑制作用的物质称为抑制剂。 酶-蛋白质变性 去激活作用 抑制作用必需基团性质改变专一性不可I：（1）Ks亲和标记试剂Ks型抑制剂的特点：与S结构类似；有活泼基团（2）kcat型：特点：具有天然S的类似结构本身也是酶的Si，可被酶催化 kcat 抑制剂具有潜伏性反应基团，可因酶的催化而暴露or活化，并作用于酶的活性中心。即Si经催化后才能形成酶的不可逆I， Si（ kcat -I）被称为“自杀性底物”等电点（pI）：蛋白质上净电荷为零时的pH值，由蛋白质上带正、负电荷的氨基酸残基数目和滴定曲线所决定。透析：利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。盐溶：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。蛋白质一级结构：指多肽链上各种氨基酸的排列顺序及二硫键的位置凝胶过滤法：即分子筛层析，是根据分子大小测定分子量的有效方法。 SDSPAGE法：在含有巯基乙醇的SDS溶液中煮沸蛋白质，能打开蛋白质的氢键、疏水键、二硫键、SDS结合到蛋白质分子上，并使组成蛋白质的各条链分开。质谱法：将被分析的分子（分析物）先在一个真空室中离子化，当新带上电的分子被引入电场或磁场时，它们在场中走过的路径是一个质量电荷比m/z的函数。不同电离离子的这一特性是可测知的，并用于推到分析物的精确质量。同源蛋白质：进化上相关的一组蛋白质。不同物种的同源蛋白质是长度相同或相近多肽链。氨基酸序列的许多位置在所有物种中被同样的残基占据，这些残基叫做不变残基；而另一些位置则表现出相当的可变性，这些残基称为可变残基天然蛋白质处于有功能的、折叠状态下的蛋白质称为天然蛋白质。构象:蛋白质中原子的空间排列称为构象。二级结构：白质肽链骨架中局部肽段的稳定构象。是完整肽链构象（三级结构）的结构单元，是蛋白质复杂的空间构象的基础，因此也被称为构象单元。蛋白质的三维结构：由一级结构决定的，是多肽链上各个单键旋转自由度受到各种限制的总结果。分子伴侣：与部分折叠或不正确折叠的多肽链相互作用的蛋白质，能够加速正确折叠的进行或提供折叠发生所需的微环境。陪伴蛋白：它们是许多不能自发折叠的胞内蛋白质进行折叠所需要的精巧复合物。超二级结构也叫基序，或简称折叠，是几个二级结构及其连接的特别稳定的排列。结构域：残基数量超过几百个氨基酸的多肽经常折叠成两个或更多稳定的球状单元，也叫做。蛋白质家族：功能相似而氨基酸残基变异率50%的若干蛋白质，称为蛋白质家族蛋白质超家族：不同蛋白质家族之间，氨基酸残基的相似率50%，且具有相似或相近的功能，称为蛋白质超家族。超家族蛋白质常具有共同的超二级结构和结构域。 四级结构：以三级结构的球状蛋白质的聚集体形式存在的，通过非共价键彼此缔合在一起，这样的聚集体称为蛋白质的四级结构。亚基：四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基。原体：对称的寡聚蛋白质可视为两个或多个不对称的相同结构成分组成，这种相同结构成分称为原体。变性：由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生变化，导致生物活性丧失及物理化学性质的异常变化，这一过程称为变性。不可逆变性：变性因素去除后并不易复性可逆变性：