抗生素效价测定操作规程.doc

QCA/QC-SOP-006山东良福制药有限公司起草人日 期抗生素效价测定操作规程审核人日 期批准人日 期第五版实施日期总页数共4页1. 主题内容和适用范围本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。2. 引用标准中国药典2010年版二部。3. 术语抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。4. 操作技术（仪器与用具）4.1 操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25。注意抗生素的污染。4.2 双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160干热灭菌2小时或高压灭菌12130min,备用。4.3 陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。4.4 钢管：内径6.00.1mm高7.80.1mm或8.00.1mm,10.00.1mm.重量差异不超0.05g.用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160干热灭菌2小时备用.4.5 钢管放置器4.6 恒温培养箱:隔水式为宜35-374.7 灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160干热灭菌2小时备用.4.8 玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水洗、PW冲3次4.9 称量瓶:具塞,重量在10g以下.水冲洗、淋干,置清洁液浸泡2小时以上,水洗、PW冲3次,置洁净的大平皿中.120干热3h,待冷到70-60时,取出置干燥器中备用.4.10 毛细滴管: 清洁液浸泡, 水洗、PW冲3次.120干燥3h4.11 天平:分析天平,感量0.1mg4.12 抑菌圈测量仪(多功能微生物自动测量分析仪)4.13 超净工作台5. 菌悬液制备取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，加灭菌水12ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，摊布均匀，在3537培养7天。取菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水10ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在65水浴中加热30分钟将菌体杀死，待冷后置4冷藏箱贮藏。此菌液为浓菌液。日常试验用菌液 取上述浓菌液，用灭菌水13稀释至灭菌试管中，冷藏箱保存备用。6. 培养基称取培养基干粉g溶于ml水中，制备好的培养基，在120121蒸汽灭菌30min。制成的培养基不应有沉淀，临用前应置于水浴中或微波炉中融化，避免直火加热。7. 缓冲溶液制备磷酸盐缓冲溶液（PH7.8） 称取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml,滤过，在120121蒸汽灭菌30min。8. 灭菌水制备取纯化水500ml，在120121蒸汽灭菌30min。9. 样品及供试品制备（标准品的取用量不得少于20mg）9.1 称样量计算 V C W=- P式中 W 为称取标准品或供试品的重量（mg） V 为溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积（ml） C 为标准品或供试品浓溶液的浓度(u/ml或g/ml) P 为标准品的纯度或供试品的估计效价(u/mgg/mg)9.2 稀释(每步稀释，量取量不得少于2ml，稀释步骤一般不超过3步) 标准品及样品（以红霉素为例）乙醇+灭菌水 mg (u/mg) - ml (u/ml)PH7.8磷酸盐缓冲溶液 ml (u/ml) - ml (u/ml)高剂量PH7.8磷酸盐缓冲溶液 ml (u/ml) - ml (u/ml)低剂量PH7.8磷酸盐缓冲溶液 ml (u/ml) - ml (u/ml)10. 双碟制备10.1 在半无菌室内进行，应注意微生物及抗生素的污染。10.2 底层 用灭菌大口20ml吸管或其他灭菌分装器，吸取已融化的培养基20ml注入双碟内，使底层摊布均匀，盖上陶瓦盖，待凝固。10.3 菌层 取出实验用菌悬液，按预试好的加菌量，用灭菌吸管吸取菌悬液适量，加入已融化并保温在水浴中的培养基（65以下）内，摇匀，作为菌层培养基。用灭菌大口5ml吸管或其他适宜分装器，吸取菌层培养基5ml，加于底层培养基上，使其均匀摊布，放置2030分钟，待凝固。10.4 放置钢管 用小眼科镊子夹持钢管，轻轻地放置在培养基上。相应剂量的钢管，对角放置。钢管放妥后，应使双碟静置510分钟，钢管在琼脂上沉稳后，再开始滴加抗生素溶液.10.5 滴加抗生素溶液10.5.1 10.5.1每批样品不少于6个双碟，用灭菌的毛细滴管滴加，在滴加之前须用溶液洗23次。10.5.2 滴加标准品及供试品溶液顺序：SH-TH-TL-SL滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液的间隔不可过长，否则因钢管内溶液的扩散时间不同会影响测定结果。加液要满，但不能溢出，同一双碟内4个钢管的加液量要一致。10.5.3 每种溶液要各用一支毛细滴管，每1份滴加的溶液为同一单位，但双碟数不超过5个，如果一份溶液滴加双碟数目多，可分次滴加。10.5.4 加完抗生素后，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3层，置入隔水式培养箱内培养，