mirRNA的定量实验方案.doc

1、 实验目的：RD细胞定量检测miR188;miR657;2、 实验材料及试剂：超净台 （上海净化设备厂）生物安全柜 （ESCO，Singapore）,细胞培养箱 （Heraeus，Germany）,分光光度仪 （Eppendorf，Germany）,PCR仪 （Eppendorf，Germany）,冷冻离心机 （Eppendorf，Germany）,移液枪（Eppendorf，Germany），（real-time试剂盒（takara），显微(coic,重庆光学仪器厂），计数板；,异丙醇（上海化学试剂有限公司），八连管；100%乙醇（上海化学试剂有限公司）,细胞培养液 （Gibco，USA），氯仿（上海化学试剂有限公司）,EDTA-胰酶 （Gibco，USA）,Trizol （Invitrogen，USA） 三、实验过程（1） RD细胞的收集1.培养传代RD细胞，待细胞生长状态良好，密度约80%时进行收集；2.倒掉细胞培养液，加入1ml的胰酶于培养瓶中，混匀后将其吸掉（防止消化过度)静置，在显微镜下观察细胞开始变圆（细胞成流沙状流下时）；.加入1ml的培养液，吹打混匀，对其进行细胞计数，按照公式（四个大方格/4)104稀释的倍数=细胞原液量/ml.记录数据。取出200ul的该细胞悬液于经DEPC处理的EP管中。（2） Trizol抽提总RNA1. 取出上步所收集到的细胞悬液。 2. 加入1ml Trizol，颠倒3-4次，室温静置10min。3. 每1ml Trizol加入0.2ml氯仿剧烈震荡15sec，室温放置5min。4. 4，12000g低温离心15min，此时样品分为三层：上层为无色水相，中间层为白色底层为黄色有机相。5. 吸约650ul的上清液于新的Eppendorf管。6. 加入等体积650ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下20min(-20沉淀1小时以上)。7. 4，12000g低温离心15min。8. 去上清，加入1ml 75%乙醇，4，10000g低温离心8min，重复一次。9. 倒掉乙醇，自然晾干，不可用太大力；室温放置510min干燥RNA沉淀。10. 用含有1U/l RNA酶抑制剂的水20 l溶解。11. 收集标记提取出的RNA,待用；（3） RT1. 注意：做之前要用分光光度仪测定RNA的量； 水的量要根据实验的具体情况来加，使得最后反应体系是10ul。 在此步的同时要做内参5sRNA的逆转录 2.反应体系如下：(分开进行，三组反应）RNA2.0ul(0.1-1.0g)HN RT-X(1uM)1.0ul2.5mMdNTP2.0ul(Final 0.5mM)dH2O2.0ul HN RT-657 HN RT-188-3p R-5SrRNA 80变性5分钟，然后迅速在冰上急冻5分钟. 向反应管中加入：5RTBuffer2.0ulRTase(100-200U/ul）1.0ul 4245min.后855min使得逆转录酶失活。 （ 四）Real-time PCR注意：要用5sRNA做内参和水做阴性对照；做复孔； 10ul水HN miR-X-F(1uM)1.0ulHN miR-X-R(1uM)1.0ulcDNA2.0ul2xSyBGreen Mix5.0uldH2O1.0ul5倍稀释 10 20 40 80 160 32010ulHN miR-657-F F-5SrRNA HN miR-657-R R-5SrRNA HN-188-3p-FHN-188-3p-R40ul水10ul10ul10ul10ul10ul10ul样本2.稀释好的模板按如下体系进行加样： 1.cDNA稀释 10ul水 10ul水 10ul水 10ul水 10ul水3. 要用到六排八连管，每三排为一组，分别测定miR188a-3p和miR657。样本做两排，做复孔，每一排的第一孔加水做阴性对照；前两排的其余七孔按照上图