Protein A Resin纯化抗血清.doc

Protein A Resin（Cat.No.L00210）纯化抗血清操作程序1 实验原理Protein A亲和层析介质是纯化和分离IgG常用手段。Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。天然Protein A有5个IgG结合域和许多其它的未知功能域。重组Protein A包含5个高IgG结合域(Ka=108/M)，并去除了其它非主要结合域以降低非特异性结合。目前，Protein A亲和层析介质已经广泛用于从生物流体或细胞培液中分离纯化各种类型的IgG或者IgG片段。实验已经证明，Protein A和IgG的相互作用仅涉及Fc区域，而不影响Fab片段和抗原的结合。Protein A Resin（Cat.No.L00210）的特性Resin 体积 5ml（10ml含5ml浆液）配体 E.coli表达的重组链球菌Protein A每个配体结合IgG位点的数目 5配体的分子量 约34kDa配体的PI 5.17配体密度 2mg重组蛋白A/mlresin静态结合能力 大于20mg猪IgG/ml Resin基质 4%琼脂糖凝胶颗粒大小 90m（45-165m）储存液 含20%乙醇的1XPBS储存条件 4-8有效期 未开封前可保存12个月2 实验试剂和器材2.1实验试剂Na2HPO4、NaCl、甘氨酸、浓盐酸、Tris、蒸馏水、20%乙醇2.2实验器材Protein A Resin（金斯瑞生物科技 L00210）、4冰箱、PH计或PH试纸、锥形瓶、量筒、漏斗、移液器、tip头、试剂瓶、0.22m滤膜、注射器、纯化柱（约10ml）2.3样品 抗血清2.5ml（约20mg IgG/ml Resin，根据血清中IgG含量正常范围 7.616.6gL，每mlResin可以纯化至少1.2ml血清，本实验按2mlProtein A纯化抗血清2.5ml进行试验。）3 实验步骤3.1 溶液配制3.1.1 结合液/冲洗液的配制Na2HPO4 2.84g（20mM），NaCl 8.77g（0.15M），加入800ml蒸馏水中，用盐酸调至PH 8.0，补蒸馏水至1000ml，0.22m滤膜过滤，4封存备用。3.1.2 洗脱液的配制甘氨酸-盐酸缓冲液：0.1M甘氨酸7.057g（0.1M）加入800ml蒸馏水中，用盐酸调至PH 2.5。0. 22m滤膜过滤，4封存备用。3.1.3 中和液的配制Tris-HCl缓冲液:Tris121.14g(1M) 加入800ml蒸馏水中，用盐酸调至PH 8.5。0. 22m滤膜过滤，4封存备用。3.2 样品准备抗血清样品2.5ml过滤（0.22m滤膜）去除样品中的颗粒杂质，加入等体积的结合液/冲洗液稀释。3.3 准备纯化柱3.3.1 预先在新的纯化柱（10ml的纯化柱）里加入2ml结合液/冲洗液，然后将完全混匀的浆液4ml （含Protein A Resin 2ml）加入到此柱中。3.3.2 使Protein A Resin浆液沉降并使结合液/冲洗液顺柱流出。3.3.3 缓慢加入10ml结合液/冲洗液平衡纯化柱，结合液/冲洗液顺柱流出，保持流速约1ml/min。3.4 样品纯化3.4.1 缓慢加入样品，保持流速约1ml/min。收集流出溶液，通过SDS-PAGE电泳检测纯化柱的有效率。3.4.2 缓慢加入4-10ml结合液/冲洗液平衡纯化柱（结合液的量由血清的溶血程度决定，溶血程度较高，冲洗需要量大，本人判断标准Protein A 的颜色变到未加入抗血清前的颜色），保持流速约2ml/min。3.4.3 缓慢加入10ml洗脱液，保持流速约1ml/min。收集包含IgG的洗脱液，并立即加入中和液,(每ml收集液加入90ul中和液)。利用紫外分光光度计检测蛋白含量并收集含量较高的部分。（一般10ml洗脱，收集4-5ml蛋白含量较高的IgG洗脱液）3.5 重生纯化柱缓慢加入10ml洗脱液重生纯化柱，然后加入5ml结合液/冲洗液平衡纯化柱。重生后的填料可以重复利用达10次，结合能力不会明显减弱。3.6 保存将重生的Protein A Resin保存在含20%乙醇的结合液/冲洗液中，4-8保存备用（勿冷冻）。4 问题与解决方法4.1 流速太慢（0.5ml/min）。可能原因缓冲液或样品中有小的气泡。解决方法：保证缓冲液和样品中无气泡，勿使纯化柱干燥。4.2 一定量的样品纯化后目标抗体未检测到。可能原因抗体浓度太低。解决方法：使用结合了特异抗原的纯化介质。4.3 抗体效价降低。可能原因抗体对PH值过低的洗脱液敏感。解决方法：洗脱后立即加入中和液中和。4.4 在任何洗脱液中都未检测到抗体。可能原因IgG的亚类与ProteinA不结合。解决方法：试用其他纯化介质，例如Protein G Resin 或Protein L Resin。Protein A 和 Protein G 与不同物种及其亚类免疫球蛋白的结合能力表Species Subclass Protein A binding Protein G bindingHuman IgA varible IgD IgE IgG1 + +IgG2 + +IgG3 +IgG4 + +IgM variable Avian egg yolk IgY Cow + +Dog + +Goat +Guinea pig IgG1 + +IgG2 + +Hamster + +Horse + +Koala +Llama +Monkey (rhesus) + +Mouse IgG1 + +IgG2a + +IgG2b + +IgG3 + +IgM variable Pig + +Rabbit no dis