念珠菌性阴道炎的典型症状是瘙痒可伴有外阴烧灼感外在的排尿困难.doc

念珠菌性阴道炎的典型症状是瘙痒可伴有外阴烧灼感外在的排尿困难 罗夫他辛胶囊临床研究者手册 一、序言罗他夫辛胶囊是CVie TherapeuticsCompany Limited（又名“中国生命药物治疗有限公司”）公司所有的口服肠溶胶囊，主要成分为罗他夫辛（INN名Rostafuroxin，研究代号罗他夫辛）。 本品目前正在意大利进行II期临床研究，用于治疗原发性高血压。 本品尚未在国内外上市，在中国申请进行IIb期的国际多中心临床试验，并同时附加申请特殊审批程序，本次申请属于进口（含港、澳、台）化学药品临床试验批准，其分类按药品注册管理办法附件二注册分类，为化学药品注册分类1。 本手册介绍了罗他夫辛胶囊相关理化性质、动物药理毒理药代及人体临床试验相关资料结果总结及评价。 二、药学部分1.药物基本信息罗他夫辛是罗他夫辛胶囊的活性成份，其化学名为17-(3-呋喃基)-5-雄甾烷-3,14,17-三醇，分子式为C23H34O4，分子量为374.52，化学结构式如下本品为白色晶状粉末。 在水中极微溶解，在DMSO（1%水）中微溶，在甲醇中溶解，在乙腈和丙酮中略溶。 2.处方本品为口服肠溶硬胶囊，分为三个规格，分别为6g、50g和500g。 每瓶含45粒，辅料为甘露醇、微晶纤维素、羟丙纤维素、聚维酮、十二烷基硫酸钠、硬脂酸镁、4号不透明白色空心胶囊及包衣材料。 处方以1000单位计如下成分单位处方功能6g50g500g罗他夫辛0.0064g*0.0537g0.5365g活性成分甘露醇30.2436g*80.1936g79.7135g稀释剂微晶纤维素10.00g10.00g10.00g稀释剂羟丙纤维素5.00g5.00g5.00g配基聚维酮3.0g1.50g1.50g分散剂十二烷基硫酸钠1.00g1.00g1.00g表面活性剂硬脂酸镁0.75g0.75g0.75g润滑剂4号不透明白色空心胶囊1000粒1000粒1000粒胶囊壳欧巴代20M29149(?Colorcon)30.58g30.58g30.58g包衣材料雅克宜93F19255(?Colorcon)25.44g25.44g25.44g包衣阻滞剂本品原设计为普通硬胶囊，由于罗他夫辛对酸性pH敏感，因此对胃液也非常敏感。 为了降低个体之间的差异，因此在胶囊生产工艺中加入肠溶包衣这一步骤。 本品外观为白色至类白色不透明胶囊，内容物为白色至类白色粉末。 3.制备工艺罗他夫辛通过两步合成制备。 步骤117-羟基洋地黄毒苷配基（PST2286）制备步骤2罗他夫辛（PST2238）制备洋地黄毒苷配基氧化得到17-羟基洋地黄毒苷配基，17-羟基洋地黄毒苷配基反应还原成罗他夫辛。 罗他夫辛所有规格的生产工艺相似。 差别主要在于处方中活性成份用量。 由于设备的容量限制，现生产工艺中6g规格制备两个亚批的含有API的干燥颗粒以及50和500g规格制备三个亚批的含有API的干燥颗粒，然后亚批混合在一起得到一批制剂的干燥颗粒。 亚批次制备的主要步骤包括原辅料过滤、混合部分辅料、配制活性药物悬液、活性药物悬液向部分辅料混合物喷洒，加入崩解剂，然后混合亚批次，加入润滑剂，混合后灌装，肠溶包衣材料包衣。 4.药物使用信息4.1临床适应症及用法用量未治疗过的原发性高血压，且携带有编码可引起哇巴因水平升高的、参与哇巴因合成和代谢过程的酶和/或突变内收蛋白的遗传图谱。 每天1次，剂量待定。 4.2不良反应健康志愿者中，110mg/天剂量的罗他夫辛连续给药7天并不会导致出现任何药物相关不良反应，因此可认为上述剂量在健康成人中具有极佳的治疗耐受性。 高血压患者中开展的三项临床研究也无任何治疗安全性担忧，表明罗他夫辛在高达5mg/天的剂量条件下仍具有极佳的治疗耐受性。 4.3禁忌症继发于明确原因的高血压患者禁用；严重的或恶性的高血压患者禁用；患有显著肾脏、心脏和肝脏疾病患者；使用能影响血压的合并治疗药物患者；接受任何研究中药物治疗的患者禁用；30kg/m2肥胖患者禁用；糖尿病患者（禁食血浆葡糖浓度125mg/dl）禁用；接受他汀类药物治疗的患者禁用。 5.稳定性研究B004304批次在加速条件（T=302，RH65%5%和T=402，RH75%5%）下保存6个月；在长期条件（T=53，不控制RH和T=252，RH60%5%）下保存24个月。 稳定性标准包括和批放行标准同样的检验参数，但排除了不具有稳定性指示性的参数。 稳定性试验期间仅控制降解产物PST2362，其他杂质PST 2286、PT2681和PST2540合成工艺，所以不具有稳定性指示性。 活性成分在描述的条件下非常稳定。 已经确定在53下储存复验期为24个月。 另对FARMABIOS生产的原料药0011010批次进行了降解条件下的稳定性试验。 制剂稳定性试验使用的胶囊批次是使用最新生产活动 （xx）生产的原料药进行生产，API在53下储存，在复检期xx年和xx年前使用。 考虑到将开始生产新的原料药和制剂的临床批次，研发批次的稳定性数据可视为最坏情况（老原料药），支持所有规格临床批次的货架期为25以下保存24个月。 将对6g、50g和500g规格罗他夫辛临床批次开展ICH稳定性试验。 研发批次的当前稳定性数据提供在下表中批号规格储存条件状态PD092186g5324个月可用PD092186g252RH=60%5%24个月可用PD092186g302RH=65%5%6个月可用PD0921950g5324个月可用PD0921950g252RH=60%5%24个月可用PD0921950g302RH=65%5%6个月可用PD09220500g5324个月可用PD09220500g252RH=60%5%24个月可用PD09220500g302RH=65%5%6个月可用通过比较500g和50g胶囊的稳定性趋势数据，可以得出结论50g胶囊也可以在252RH=60%5%下稳定储存24个月。 三.药理毒理部分1.药理作用机制在说明罗他夫辛的药理作用机制以前，有如下几点需要事先说明 （1）Na+/K+-ATPase不但具有钠钾泵活性，还与非受体类激酶Src形成复合物而具有信号传递功能，都与高血压及其并发症的发生发展有关。 （2）内源性哇巴因水平升高和突变型内收蛋白在人体和动物中确实能够增加Na+/K+-ATPase的钠钾泵活性1,2,3,4,5；引起钠离子重吸收增加、体内水钠潴留。 人体内源性哇巴因正常水平约为10-380pM，原发性高血压患者可升高至1nM或更高。 （3）内源性哇巴因确实可以激活Na+/K+-ATPase Src复合物的信号传递，进而影响EGFR、ERK1/2等通路，以此控制细胞的生长、增殖、蛋白和糖原的合成、凋亡等6,7。 此通路的激活是哇巴因诱发高血压相关器官肥大的机制，也被认为参与了高血压的发生。 我司在体外也证明了突变型内收蛋白具有此作用机制，但在相关高血压体内动物模型中（NA大鼠）未显示出高血压相关的器官肥大。 （4）内源性哇巴因水平升高和突变型内收蛋白是可以共同存在于高血压个体中的，两者可以起到协同升压作用3,4。 我司在用纯化的Na+/K+-ATPase和大鼠肾脏NRK细胞（短期4小时培养）测试哇巴因对Na+/K+-ATPase的钠钾泵活性的影响时（详见表1），得到了哇巴因可以剂量依赖性地抑制其钠钾泵活性，这与上述几点以及我司的预计完全不符合，更与哇巴因的应对钠离子耗竭功能不符。 我司为了弄清哇巴因是否能够增加钠钾泵活性及其相应的机制，先是用大鼠肾脏NRK细胞与哇巴因共培养5天，结果显示10-10至10-8M浓度哇巴因（生理浓度至高血压患者体内浓度）显著增加钠钾泵活性；那为何5天培养和4小时培养得到的结果不一样，一个增加另一个则抑制？我司接着用真菌毒素Brefeldin A（Brf A）、NRK细胞和哇巴因共培养的方法来研究哇巴因的促进钠钾泵活性的机制，结果表明哇巴因（10-9M浓度，即部分原发性高血压患者体内浓度，高于正常个体体内浓度）可使Na/K泵的内摄速率减少将近50%；这与突变型内收蛋白一样，都可以减少钠钾泵的内吞，最终增加肾脏上皮细胞基底膜侧钠钾泵数目（蛋白质合成需要一段时间，因此在哇巴因与NRK细胞4小时培养后可能未增加钠钾泵数量）7。 因此，内源性哇巴因水平升高和突变型内收蛋白都可通过减少钠钾泵的内吞（这是用纯化的Na+/K+-ATPase和短期NRK细胞培养无法完成的），增加钠钾泵数目的方法来显著增加钠钾泵的活性。 而我司开发的罗他夫辛在与大鼠肾脏NRK细胞以及10-9M浓度（部分原发性高血压患者体内浓度，高于正常个体体内浓度）哇巴因共培养5天后，10-14至10-9M的浓度下使得哇巴因依赖性Na/K泵活性增加正常化，10-12M和10-10M达到显著性。 这样的结果是由于 （1）在用纯化的Na+/K+-ATPase进行的结合实验中，罗他夫辛可以置换出3H哇巴因； （2）在用NRK细胞进行的实验中，5天培养后，10-16至10-8M的PST2238（罗他夫辛）对钠钾泵活性无影响；而4小时培养时，高达10-4M浓度时也未对钠钾泵活性产生影响；这与哇巴因截然不同； （3）在用真菌毒素Brefeldin A（Brf A）、NRK细胞、哇巴因和罗他夫辛共培养进行的实验中，哇巴因和PST2238均以10-9M的浓度联合用药使得Brf A降低Na/K泵活性的效应恢复至12%（p0.02），这与在未给药的NRK细胞中存在Brf A条件下观察到的类似，即罗他夫辛可使钠钾泵的内吞恢复正常。 总之，罗他夫辛可置换出与钠钾泵结合的哇巴因，使钠钾泵的内吞恢复正常，且在10-16至10-8M浓度范围内不对钠钾泵的活性产生抑制或激活作用，最终使得其能够在10-14至10-9M的浓度下使得哇巴因依赖性钠钾泵活性增加正常化。 同样地，罗他夫辛可能通过类似的机制使得突变型内收蛋白依赖性钠钾泵活性增加正常化。 罗他夫辛除了能够使得内源性哇巴因和/或突变型内收蛋白诱导的钠钾泵活性增加正常化外，还能够抑制哇巴因水平升高和突变型内收蛋白诱导的Na+/K+-ATPase Src复合物信号通路激活，但对野生型内收蛋白无相应作用。 我司为了证明罗他夫辛具有此作用机制，分别进行了 （1）对渗透泵注射15g/kg/day的哇巴因诱导的高血压大鼠（OS大鼠）每天灌胃给予PST2238（10g/kg/day，此剂量在该模型中具有显著的降压作用，具体可见下面的主要药效学部分)一次，共12周。 结果表明，OS大鼠 1、1和Na/K ATP酶，EGFR，Src和Src-显著增加并在小窝膜分离液中富集化；PST2238治疗逆转了在小窝上哇巴因诱发的 1、1和Na+/K+-ATPase，EGFR，Src和Src-显著增加，并且能够抑制哇巴因诱导的ERK活化作用。 （2）用突变（460Trp）或野生（460Gly）型人类重组内收蛋白遗传变体引起的Src激酶活化模型评价PST2238（10-8M到10-12M）的作用，结果表明，突变型内收蛋白更能高度激活Src内收蛋白Na+/K+-ATPase信号传播路径。 10-11M（最强）的罗他夫辛可以选择性抑制由突变内收变体诱发的Src活化程度，但是并不能抑制由野生型内收蛋白所诱发的Src活化程度。 因此罗他夫辛能够抑制哇巴因水平升高和/或突变型内收蛋白诱导的Na+/K+-ATPase Src复合物信号通路激活总之，罗他夫辛作为第一种新型的、设计为拮抗突变型内收蛋白和内源性哇巴因水平增加这两个高血压发病机制的降压药物，它可纠正内源性哇巴因水平增加和突变型内收蛋白-依赖性高血压中肾脏和血管Na+/K+-ATPase的活性（钠钾泵功能和信号传导功能）改变。 具体作用机制为其与Na+/K+-ATPase结合，进而阻断突变型内收蛋白以及内源性哇巴因与Na+/K+-ATPase间的相互作用，使Na+/K+-ATPase活性正常化，抑制Src的激活和Na+/K+-ATPase磷酸化，但是并不引起利尿效应，不增加水钠排泄。 2.临床前主要药效学在分析评价罗他夫辛的主要药效学前，有必要对所用高血压动物模型与哇巴因（或称哇巴因样物质，OLF）、突变型内收蛋白的关系作一说明 （1）MHS大鼠含有升高的体内哇巴因样物质水平和突变型内收蛋白； （2）NA大鼠转入MHS大鼠中编码突变型内收蛋白的基因； （3）OS大鼠SD大鼠长期输注 15、45或50?g/kg的哇巴因； （4）DOCA-Salt大鼠体内哇巴因样物质水平升高； （5）RRM大鼠体内哇巴因样物质水平升高； （6）SHR大鼠与两个机制均不相关。 与此相对应的是，我司在用这些动物模型评价罗他夫辛（PST2238）的降压药效时，发现罗他夫辛在SHR大鼠中无降压效果，在其余几种高血压大鼠中有相应的显著降压效果，这进一步佐证了罗他夫辛的作用机制针对的是内源性哇巴因水平增加和/或突变型内收蛋白诱发的Na+/K+-ATPase活性改变（钠钾泵活性和Src信号传导通路活性）。 在数个用MHS高血压大鼠进行的降压药效评价实验中，发现0. 1、 1、 3、10mg/kg均能够显著降低血压，并没有剂量依赖性；为了显示剂量依赖性，进一步降低剂量至0. 1、 3、90g/kg和3mg/kg，在此实验中，罗他夫辛剂量依赖性地降低MHS大鼠的血压，在0.1g/kg时无降压效果，ED50=4g/kg。 同时发现MHS大鼠未给药组的肾脏Na+/K+-ATPase活性和mRNA表达较相应的正常血压大鼠-MNS大鼠显著增加，而罗他夫辛的降压作用与其正常化这些增加了的Na+/K+-ATPase活性和表达相对应。 在数个用OS高血压大鼠进行的降压药效评价实验中，发现0. 1、 1、10和100?g/kg剂量均能显著降低血压，并没有剂量依赖性；为了显示剂量依赖性，进一步降低剂量至 0、0. 01、1和100?g/kg，在此实验中，罗他夫辛剂量依赖性地降低OS大鼠的血压，在0.01同时发现MHS大鼠未给药组的肾脏Na+/K+-ATPase活性和mRNA表达较相应的正常血压大鼠-MNS大鼠显著增加，而罗他夫辛的降压作用与其正常化这些Na+/K+-ATPase活性和表达相对应。 时无降压效果。 同时发现OS大鼠未给药组的肾脏Na+/K+-ATPase活性较相应的正常血压大鼠-CS大鼠显著增加，而罗他夫辛的降压作用与其正常化这些增加了的Na+/K+-ATPase活性相对应。 此外，还使用了与哇巴因样物质体内水平升高相关的高血压大鼠模型-DOCA-Salt大鼠和RRM大鼠来评价罗他夫辛的降压药效，结果发现罗他夫辛对这些高血压大鼠也具有一定的降压效果。 除了评价罗他夫辛的降压药效外，也用MHS大鼠、NA大鼠和OS大鼠等高血压大鼠模型进一步评价了罗他夫辛对哇巴因水平升高和/或突变型内收蛋白引起的心脏、肾脏肥大以及血管收缩性改变的作用。 在实验中，我司发现NA大鼠（仅具有突变型内收蛋白发病机制）不显现心脏肥大，而OS大鼠和MHS大鼠（都具有哇巴样水平升高发病机制）都显现心脏、肾脏肥大，这与我司进行的体外实验有些许不同，但不管如何，可以肯定的是，哇巴因水平升高是心脏、肾脏肥大以及血管收缩性改变的主要病因。 在数个用OS大鼠进行的防治心脏、肾脏肥大以及血管收缩性改变的实验中，15?g/kg剂量的哇巴因输注，较短期限（10周）可引起OS大鼠轻微但显著的心脏肥大，长期（18周）可引起显著的心脏、肾脏肥大；而更高剂量的50?g/kg剂量的哇巴因输注，较短期限（10周）可引起OS大鼠肠系膜动脉的血管收缩性改变，这些OS大鼠都有高血压。 在15?g/kg剂量的哇巴因输注的OS大鼠中， 1、10?g/kg剂量的罗他夫辛不管是给药4周还是12周都可明显地降低血压，都可以拮抗心脏（左心室）肥大和/或肾脏肥大（1?g/kg剂量的罗他夫辛在12周给药时仅能拮抗肾脏肥大）；但是，氨氯地平虽然可以显著降低OS大鼠的血压，但不能拮抗心脏肥大的出现，因此，如上文所述，罗他夫辛这种拮抗效应的机制是正常化了哇巴因诱导的Na+/K+-ATPase Src信号通路激活。 在50?g/kg剂量的哇巴因输注的OS大鼠中，100?g/kg剂量的罗他夫辛正常化了肠系膜动脉的血管收缩性。 同时也在数个MHS大鼠进行的防治心脏以及血管收缩性改变的实验中，100?g/kg剂量的罗他夫辛在给药6个月后，拮抗了MHS大鼠的左心室肥大效应；500?g/kg剂量的罗他夫辛在给药6个月后，显著降低了MHS大鼠肠系膜动脉对血管紧张素II的敏感性。 此外，虽然呋塞米、坎利酮等利尿药物同罗他夫辛一样能够显著降低MHS大鼠的血压（所需罗他夫辛剂量远小于利尿药物），但是罗他夫辛在降压的同时并不产生利尿的作用，不增加水钠的排泄，这不同于利尿药物（如氢氯噻嗪、呋塞米、螺内酯-坎利酮等）。 为了进一步说明这种不同，我司在MHS大鼠中使用这些药物评价了它们对大鼠血浆临床化学参数的影响，结果表明，PST2238未影响血浆指标；氢氯噻嗪引发低钠血压，激活肾素醛固酮系统及高血糖、高尿酸血症；呋塞米引发低血钾，激活肾素醛固酮系统及高血糖、高尿酸血症；坎利酮只引发了高尿酸血症。 因此，罗他夫辛对于利尿降压药物更加安全，针对性更强。 总之，罗他夫辛在由哇巴因水平升高和/或突变型内收蛋白引起的高血压大鼠中能够剂量依赖性地降低血压，也能够在与哇巴因水平升高相关的高血压大鼠中降低血压，更能拮抗哇巴因水平升高导致的心脏、肾脏肥大以及动脉血管收缩性改变；但在与哇巴因水平升高和/或突变型内收蛋白无关的高血压大鼠中无降压效应。 罗他夫辛与氨氯地平、利尿降压药物相比，作用机制不同，针对性更强，效能更高，不但能降压，还能拮抗心脏、肾脏肥大以及动脉血管收缩性改变，而且副作用更少。 表1罗他夫辛临床前药理、药效实验资料汇总研究项目试验系统剂型剂量/浓度给药途径给药期限和频率主要研究结果罗他夫辛的作用机制研究Na-K-ATP酶与受体的结合以及罗他夫辛对酶的抑制作用犬肾脏Na-K-ATP酶与PST2238和/或哇巴因共培养溶液测定IC50，一系列浓度，10-4至10-9M共培养共培养45分钟（置换实验），15分钟（酶活性实验） （1）PST2238或哇巴因从Na-K-ATP酶上置换出3H哇巴因，IC50为分别为2.310-6M和4.510-8M； （2）PST2238或哇巴因可抑制Na-K-ATP酶活性，IC50分别为1.810-5M和4.510-8M。 在培养的NRK肾脏细胞中研究罗他夫辛对哇巴因介导的Na/K泵调节的作用大鼠肾脏NRK细胞与PST2238和/或哇巴因共培养5天 （1）和 （2），或4小时 （3）溶液 （1）10-14至10-5M（哇巴因），或10-14至10-4M（PST2238）； （2）哇巴因（10-9M）和PST2238（10-16至10-6M） （3）10-9至10-2M（哇巴因），10-9至10-4M（PST2238）共培养 （1）和 （2）共培养5天； （3）共培养4小时 （1）10-10至10-8M浓度哇巴因显著增加钠钾泵活性；10-16至10-8M的PST2238则对其活性无影响，10-6M则显著增加其活性； （2）10-14至10-9M的浓度下PST2238使得哇巴因依赖性Na/K泵活性的增加正常化，10-12M和10-10M达到显著性； （3）短期培养后（4小时），哇巴因剂量依赖性抑制钠钾泵活性，IC50值为2.0810-4M；而PST2238在10-4M时未对钠钾泵活性产生影响。 哇巴因和PST2238对培养的NRK细胞膜上Na/K泵驻留时间的影响大鼠肾脏NRK细胞与真菌毒素Brefeldin A（Brf A）、哇巴因和/或PST2238共培养溶液BrfA（10?M），哇巴因（10-9M），PST2238（10-9M）共培养哇巴因和/或PST2238共培养5天后接受30180min存在Brf A的情况下，泵活性的平均下降在未处理的细胞中为13.7%（p0.001），在哇巴因-处理的细胞中为6.3%（p0.02）。 使用10-9M的哇巴因处理5天后，Na/K泵的内摄速率减少将近50%。 哇巴因和PST2238均以10-9M的浓的Brf A处理度联合用药使得Brf A降低Na/K泵活性的效应恢复至12%（p2000mg/kg；在给药当天及观察期间均未观察到临床体征或行为出现变化。 在肉眼和显微检查中均未观察到治疗相关的变化。 4.2重复给药研究4.2.1大鼠大鼠以 45、180和720mg/kg的剂量连续一个月重复口服罗他夫辛并设立4星期恢复组。 在试验中，高剂量组雄性大鼠出现60%的死亡，雌性大鼠出现脂肪肝、肾小管扩张等，两个较低剂量组也都出现剂量依赖性的毒性反应。 因此，后续试验的高剂量设定需低于180mg/kg/day。 大鼠以 4、20和100mg/kg的剂量连续3个月口服罗他夫辛，同时设立6周恢复组。 尸检时发现，高剂量组雄性大鼠出现可逆性的肝脏重量增加，雌性大鼠出现脾脏生血作用的频率和强度增加以及大脑垂体重量的增加趋势（6周恢复期后仍可发现该毒性反应）。 因此，该试验的NOAEL值是20mg/kg。 综合考虑以上两个试验，罗他夫辛在大鼠给药3个月的NOAEL值是20mg/kg，毒性靶器官是肝脏、脾脏以及垂体。 4.2.2食蟹猴食蟹猴以 100、300和900mg/kg的剂量进行剂量范围探索试验，未出现死亡，仅在高剂量组给药2星期后出现一些可能的肝脏功能改变，但没有明显的毒性反应。 尔后，进行了一个月给药毒性试验，以 45、180和720mg/kg的剂量连续一个月重复口服罗他夫辛后，45mg/kg剂量组未发现任何毒性反应，180mg/kg剂量组观察到肝脏轻微非炎性病理改变及其相关的轻微血液学、血液生化变化，720mg/kg剂量组观察到更明显的可逆的肝脏形态学变化（其中一只猴子的肝脏炎症变化较为严重）。 最后，还进行了一项3个月给药6周恢复的毒性试验，以 5、30和180mg/kg的剂量连续3个月口服罗他夫辛后，两个较低剂量组未出现主要的毒性反应，高剂量组观察到肝脏的功能和形态学改变以及血液学变化（白细胞和红细胞减少，血小板增加）。 综合考虑以上3个试验结果，罗他夫辛在食蟹猴中的NOAEL值是30mg/kg，毒性靶器官是肝脏及造血系统。 综合考虑SD大鼠以及食蟹猴的长期毒性试验结果，SD大鼠是罗他夫辛更为敏感的动物种属，NOAEL值是20mg/kg，该数值是在MHS大鼠模型中的ED50（4g/kg/day）的5000倍，即提供了5000倍的安全范围；毒性靶器官为肝脏、造血系统以及脑垂体。 4.3致癌性尚未展开。 4.4生殖毒性已在SD大鼠中完成了一项I段生殖毒性初步试验，在新西兰大白兔中完成一项II段生殖毒性初步试验，这些初步试验为后续的主研究提供设计参考。 SD大鼠在交配前给予 0、 45、 135、400mg/kg的罗他夫辛直至大鼠怀孕7天。 高剂量组出现大鼠及其胎儿死亡，中剂量组仅出现一些轻微的非毒性的临床体征，低剂量组未观察到任何反应。 根据此试验结果，后续主研究的最高剂量可设定为135mg/kg。 新西兰大白兔在胎仔器官生成期给予 0、 45、 135、400mg/kg的罗他夫辛后，中高剂量组均出现更少的体重增加（该效应可逆），低剂量组未观察到任何反应。 因此，后续主研究最高剂量可设定在135mg/kg和400mg/kg之间。 4.5遗传毒性罗他夫辛在细菌回复突变（Ames）试验中未表现任何致突变活性，在人体淋巴细胞中未导致染色体畸变，在小鼠骨髓微核试验中未诱导任何变化，在V79仓鼠肺细胞中未诱导基因突变。 因此罗他夫辛是不致突变的。 4.6安全药理学4.6.1胃肠道系统大鼠以 3、 30、90mg/kg的剂量口服罗他夫辛不会显著影响胃肠的通行时间（木炭推进试验）、胃液分泌的容积和pH、游离和总酸度及缓冲容量（Shay方法）。 4.6.2中枢神经系统Wistar大鼠单剂量口服给予 0、 3、 30、90mg/kg剂量的罗他夫辛以及阳性对照药物氯丙嗪20mg/kg，通过Irwin标准方法评分，并检测体温。 结果显示，阳性药物氯丙嗪出现典型的精神病样效应以及体温降低，低剂量组未观察到任何效应，30mg/kg剂量组出现显著增加的恐惧症状，90mg/kg剂量组出现显著增加的自发性活动。 因此，该试验罗他夫辛的NOAEL值是3mg/kg。 4.6.3心血管系统麻醉犬以0. 01、0. 03、0. 1、0.3和1mg/kg的罗他夫辛剂量（Intralipid TM乳剂）静脉注射罗他夫辛，3个较低剂量组未观察到显著的心血管效应，在0.3mg/kg剂量组观察到显著的平均和舒张压升高，在1mg/kg剂量组观察到平均、收缩和舒张压、收缩性左心室压力等指标升高，但是这些效应持续时间非常短，且均出现在给药操作结束后，因此有理由相信这种效应是非特异的和与乳剂剂型相关的，而不与罗他夫辛相关。 罗他夫辛各个剂量组均未引发心电图和心脏传导时间出现变化。 因此，罗他夫辛在这个试验的NOAEL值1mg/kg，相对于在MHS高血压大鼠中检测到的ED50值（4g/kg），至少提供了250倍的安全范围（这还未考虑静脉给药和口服给药吸收量的差异）。 4.6.4呼吸系统清醒的未受约束的豚鼠单剂量口服给予 0、 3、 30、90mg/kg剂量的罗他夫辛以及阳性对照药物可待因300mg/kg。 通过整体体积描记法监测，结果显示阳性对照可待因引起了典型的呼吸抑制效应，而所有剂量组的罗他夫辛并未引起任何效应。 综合考虑所有的安全药理学研究，相对于在MHS高血压大鼠中检测到的ED50值（4g/kg），罗他夫辛均提供了超过250倍的安全范围。 综合考虑已完成的所有毒理学研究，相对于在MHS高血压大鼠中检测到的ED50值（4g/kg），长期毒性试验、安全药理学试验均提供了超过250倍的安全范围，且罗他夫辛不致突变。 5.临床前药理毒理综合分析和评价现有的临床前药理学研究资料表明罗他夫辛可纠正由突变性内收蛋白和/或内源性哇巴因水平升高引起的Na+/K+-ATPase的活性（钠钾泵功能和信号传导功能）改变，降低这些机制引起的大鼠高血压，还能够完全抑制哇巴因水平升高引起的心脏和肾脏肥大，但对其它高血压发病机制引起的高血压无降压效果。 同时对于这两个机制引起的高血压大鼠中，较其它降压药物具有有效性和/或安全性优势。 而临床前毒理学研究资料表明相对于在MHS高血压大鼠中检测到的ED50值（4g/kg），3个月长期毒性试验、安全药理学试验的NOAEL值均提供了超过250倍的安全范围，且罗他夫辛不致突变。 但鉴于还未进行GLP生殖毒性正式实验，所以在进行临床试验时，我司会严格限制孕妇患者的纳入。 四、临床试验主要结果及评价1.已完成的临床研究总结及评价1.1健康男性志愿者中的I期研究针对罗他夫辛胶囊在健康男性志愿者中开展了两项I期研究和一项药物代谢动力学研究，以此评估罗他夫辛在人体中的耐受性和药代动力学特点。 临床前毒理学数据提示我们应就该药物对血液系统和肝肾功能的影响进行细致的研究。 同样的，药物对患者心脏功能的影响也应进行研究，主要是通过卧位和站位时心率和血压的测定进行评价。 研究还在给药后多个时间点进行了ECG评价。 此外，为了初步了解药物的AMDE还在血液和尿液样本中对药物物质或其可能代谢产物的浓度进行分析。 第一项I期研究的目的在于确定四种不同剂量罗他夫辛（ 1、2. 5、 5、10mg）单次给药的治疗安全性和耐受性。 4组各9名受试者接受不同剂量的药物治疗，另有12名接受安慰剂给药的志愿者作为对照组。 该研究证实了罗他夫辛良好的治疗耐受性，其并不会导致临床检查（体征和症状、心率、收缩和舒张血压）、仪器检查（ECGHr、PR、QT、QTc、QRS）或实验室指标出现任何有临床意义的显著变化，且仅有极少数的不良事件报道。 研究中采集的所有血液样本中罗他夫辛的血浆浓度均低于定量限（这并不影响罗他夫辛药效的发挥，因为其可在低于pg/ml的浓度有效）。 本项研究的分析条件下，经葡萄糖醛酸苷水解作用后发现一种从尿液中清除的代谢产物，其与罗他夫辛的治疗剂量之间存在线性相关性。 从初步的药物代谢动力学数据来看可认为罗他夫辛完全经胃肠道吸收，且很可能完全由肝脏代谢形成一种或多种代谢产物。 之后还进行了一项专门的药物代谢动力学研究，其目的在于确定通过人尿液排除的罗他夫辛代谢产物。 研究中分别在给药前后采集健康受试者的尿液样本，受试者的给药方案为5mg/日，口服7天。 基线和第7天给药间隔内尿液样本的色谱比较分析证实了尿液中确实存在一种代谢产物。 但未经-葡萄糖醛酸苷-芳香基硫酸酯酶混合物处理的尿液样本中则未见此代谢产物。 针对代谢产物和专门合成标准对照的保留时间进行比较发现，PST2490代谢产物的保留时间与其一致。 因此，本项研究的数据支持了罗他夫辛形成尿液代谢产物代谢途径涉及结合后3号位羟基基团发生异构化的假设。 无论是否解离，所有尿液样本中均未见罗他夫辛物质的存在。 这样的药代动力学特点与临床前获得的结果基本相同，代谢产物也一致。 第二项I期研究采用三个剂量（0. 5、