DNA有关的6类酶.doc

高中生物学中与DNA有关的6类酶王彬1 夏焦兵2 （1 山东省东营市河口区一中 山东东营 257200 2 安徽省宣城市第三中学 安徽宣城 242000） 摘 要 高中生物学中涉及到与DNA 有关的6类酶： DNA酶、解旋酶、DNA聚合酶、逆转录酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶。通过查阅文献，对这6类酶的有关知识作一综述，并提出了相应教学建议，以期对同行的教学起到帮助作用。关键词 DNA酶 解旋酶 DNA聚合酶 逆转录酶 限制酶 DNA连接酶 1 DNA酶DNA酶，也称脱氧核糖核酸酶，是水解DNA中磷酸二酯键，生成低级多核苷酸或单核苷酸的磷酸二酯酶1。其中能够水解DNA分子内磷酸二酯键的酶又称为DNA内切酶，如DNA酶I（DNase I），DNA酶II（DNase II）等；而从DNA链的一端逐个水解下核苷酸的酶称为DNA外切酶，如牛脾磷酸二酯酶和蛇毒磷酸二酯酶等非专一性核酸酶（底物也可为RNA）。在DNase I的作用下，DNA被水解成3端为游离羟基，5端为磷酸基团的寡聚脱氧核苷酸，其平均长度为4个脱氧核苷酸残基。在DNase II的作用下，DNA被水解成5端为游离羟基，3端为磷酸基团的寡聚脱氧核苷酸，平均长度约6个核苷酸残基。牛脾磷酸二酯酶可从DNA的5羟基端开始逐个切割磷酸二酯键，蛇毒磷酸二酯酶可从DNA的3羟基端开始逐个切割磷酸二酯键2。人教版高中生物必修2教材中，艾弗里等“证明DNA是遗传物质” 的经典实验就用到了DNA酶。在该酶作用下，载有S型肺炎双球菌荚膜遗传信息的DNA被分解破坏，无法将R型菌转化成S型，从而进一步证明了DNA是转化因子。2 解旋酶 DNA分子的许多生物学功能都需要解开双链才能执行，而解旋酶就能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。解旋酶每解开一对碱基，需要水解2分子ATP。分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。如果双链DNA中有单链末端或缺口，则解旋酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。解开的两条单链随机被单链结合蛋白所覆盖，以防止重新结合成双链或被核酸酶降解3。高中生物教材明确提到了DNA复制需要解旋酶，但转录是否需要解旋酶？教材并未明确指出，不少中学教师对此也是模糊不清。事实上，在转录过程中，原核生物通过RNA聚合酶的特定亚基使DNA双链解开，也就是说，RNA聚合酶自身具有解旋的功能；而真核生物转录时，是某些蛋白转录因子（如RNA聚合酶的TF-F 和TF-H）协助RNA聚合酶形成复合物解开DNA双链，起到解旋酶的作用4。解旋酶有多种，高中所谓的解旋酶一般是指在DNA复制过程中起作用的解旋酶。3 DNA聚合酶 DNA聚合酶最早是在大肠杆菌中发现的，以后陆续在其他原核生物中找到。DNA聚合酶是DNA复制过程中必不可少的酶。在DNA聚合酶催化的DNA链延长反应中，链的游离3-OH对进入的脱氧核糖核苷三磷酸（DNA合成原料）的磷原子发生亲核攻击，从而形成3，5-磷酸二酯键并脱下焦磷酸（PPi）。形成磷酸二酯键所需要的能量来自-与-磷酸基之间高能键的裂解。可见，利用PCR技术扩增DNA无需额外加入ATP（某些中学教辅资料对此尚存错误认识）。聚合反应是可逆的，但随后焦磷酸的水解可推动反应的完成。DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸加到已有核酸链的游离3-OH上，而不能催化子链的从头合成，也就是说，它需要引物链的存在。加入的核苷酸则由模板链所决定。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA模板链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。细胞内DNA复制引物为RNA短链，而利用PCR技术在体外扩增DNA用DNA短链作引物3 5。大肠杆菌中共含有5种不同的DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶、。在复制中起主要作用的是DNA聚合酶。DNA聚合酶具有35核酸外切酶活性，能切除单链DNA的3末端核苷酸，而对双链DNA不起作用，故不能形成碱基对的错配核苷酸可被该酶水解下来，从而降低复制的错误率。DNA聚合酶还具有53核酸外切酶活性，它只作用于双链DNA的碱基配对部分，从5末端水解下核苷酸或寡核苷酸，因而该酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起重要作用。DNA半不连续合成中冈崎片段5端RNA引物的切除也有赖于此外切酶，以保证DNA连接酶将片段连接起来。DNA聚合酶具有35核酸外切酶活性，但无53外切酶活性，主要在DNA修复中起作用。DNA聚合酶和是在1999年才被发现的，它们涉及DNA的错误倾向修复3。真核生物中存在3种DNA聚合酶6，依次称为DNA聚合酶、，基本性质和细菌DNA聚合酶相同，但一般不具有核酸外切酶活性。目前认为在细胞内DNA复制中起关键作用的是DNA聚合酶。高中生物教材不仅在讲述DNA复制内容时涉及到DNA聚合酶，还在介绍PCR技术时，提到了热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。Taq酶是科学家从生活在高温泉水中的一种栖热水生菌（Thermus aquaticus）中分离纯化得到的。因此，Taq酶的一个突出特点是能耐PCR过程中的高温。一次加入Taq酶即可满足PCR全过程需求，相对于应用不耐热的Klenow聚合酶的最初PCR技术，操作简化的同时还提高了PCR产物特异性7。该酶的发现使PCR技术才真正成熟，并得以广泛应用。4 逆转录酶人教版高中生物必修2在讲述中心法则的发展时，提到了逆转录酶，该酶能以RNA为模板合成DNA。人教版选修3在讲述cDNA文库的构建时，提到了反（逆）转录过程，该过程也依赖于逆转录酶。另外，人教版高中生物必修1介绍了有关细胞衰老的端粒假说。端粒的修复和延伸?有赖于端粒酶催化。研究人员对四膜虫（Tetrahymena thermophila）的端粒酶进行纯化，发现该酶由RNA和蛋白质2部分构成，其蛋白质部分就具有逆转录酶活性8。逆转录酶催化的DNA合成反应需要模板和引物，以四种脱氧核苷三磷酸为底物，此外还需要适当浓度的二价阳离子（Mg2+和Mn2+）和还原剂，以保护酶蛋白中的巯基，DNA链的延伸方向为53。现在知道，逆转录酶是一种多功能酶，它兼有三种酶的活力：（1）它可以RNA为模板，在其上合成一条互补的DNA链，形成RNADNA杂种分子（RNA指导的DNA聚合酶活力）。（2）它还可以在新合成的DNA链上合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子（DNA指导的DNA聚合酶活力）。（3）除了聚合酶活力外，它还有核糖核酸酶H的活力，专门水解RNADNA杂种分子中的RNA，起核酸外切酶的作用1。5 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶简称限制酶，主要从微生物产生，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。因此，从科学的角度看，限制性核酸内切酶其实也是前文所述DNA酶的一种。在细菌细胞内限制酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解7。 根据限制酶识别和切割DNA 的特点，可将限制酶分为、三种类型，型和型由于无切割特异性或特异性不强故不用于基因工程，型限制酶特异性最强，用处最大，是基因工程的重要工具酶，通常所说的限制性核酸内切酶即指此类酶。型限制酶的识别序列通常由48个碱基对组成，且在两条链上反向重复，如EcoR的识别序列在一条链上是5?-GAATTC-3?，在另一条链上就是3?-CTTAAG-5?。切割后形成的片段末端，双链等长的称平末端，不等长的称黏性末端。有些来源不同的限制酶能识别和切割相同的序列，称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成的重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的黏性末端，称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割7。 限制酶在基因工程中的应用是近年来很多省市高考命题的一个热点，教师尤其要注意提醒学生它和高中意义上的DNA酶的作用区别。6 DNA连接酶 DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5?端磷酸与3?端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA中单链切口的封闭（如细胞内DNA复制时冈崎片段的连接3），也能催化两个双链DNA片段进行连接（如基因工程中目的基因与载体DNA的连接）。DNA连接酶主要来自T4噬菌体和大肠杆菌，相应可分两种：T4 DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。前者催化黏性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率高，催化反应需要ATP提供能量；后者只能催化粘性末端连接，能量由NAD+提供7。 DNA连接酶和DNA聚合酶有很大的相似性，学生极易混淆。为了帮助学生更好地区别，教师可借助图示、比喻等方法突破学生认知困难，在此基础上，让学生自行设计表格，引导学生对二者进行多角度比较。也有教师局限于高中教材的简单介绍，误以为细胞内DNA复制的子链延伸过程只需要DNA聚合酶，而不需要DNA连接酶9。 现将教材中涉及的上述6类酶的作用结果及特点概括如下： （备注：6类酶是习惯名称，并不是相互独立的酶，实际在内涵上有交叉。表中在对6类酶的作用比较时，仅取各类酶在人教版高中生物教材中的含义。） 以上6类与DNA有关的酶，主要分布在人教版必修2和选修3教材中，学习时间跨度较大。在新授课的教学中，教师只能按照它们在教材中出现的先后次序指导学生学习，难免由于学习材料的相关性产生前摄和倒摄抑制10，从而影响学生对有关酶的学习。因此笔者建议教师在复习课的教学中，可以基因工程的实践应用为背景编制教学案例，通过基因工程的原理和遗传的中心法则这一明一暗2条线索，将文中涉及的6类酶的作用有机地贯穿起来，形成结构化的知识体系，避免学生的机械记忆，增添学习兴趣，提高教学效果。主要参考文献1 沈同，王镜岩生物化学（下册）第2版北京：高等教育出版社，1991：297298，3523532 王运坤，吕显禄生物化学教程青岛：青岛出版社，1988：1411433 王镜岩，朱圣庚，徐长法生物化学（下册）第3版北京：高等教育出版社，2002：410423，580 4 谭艳华转录需要解旋酶吗生物学教学，2012，（37）7：40-415 张惟杰，吴敏，刘曼西生命科学导论北京：高等教育出版社，1999：1436 朱玉贤，李毅现代分子生物学北京：高等教育出