内脂素基因过表达对胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的影响.doc

内脂素基因过表达对胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的影响 生堡医堂苤圭!QQ!堡!旦j旦箜!鲞筮!翅堕堕!丛丛垦!i塑E!坐!卫i，!螋!y!盟!365-肥胖与胰岛素抵抗内脂素基因过表达对胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的影响孙勤李伶杨刚毅李仁哲李钶齐晓亚李生兵陈文雯刘桦唐毅Guenther Boden【摘要】目的探讨内脂素基因过表达对高脂诱导胰岛素抵抗(IR)大鼠胰岛素敏感性的影响。 方法构建大鼠内脂素基因真核表达质粒，并用该质粒转染高脂喂养诱导的IR大鼠模型。 在转染前后采用两次高胰岛素一正糖钳夹技术评价大鼠胰岛素敏感性的变化。 结果成功构建了内脂素真核表达载体pcDNA31内脂素。 实验组大鼠在pcDNA31内脂素质粒注射后3d血浆内脂素水平较注射前明显升高(219土O36vs O98O27，P 结论内脂素质粒转染使IR大鼠血浆内脂素水平升高，胰岛素敏感性增强。 【关键词】内脂素；胰岛素抗体；正常血糖高胰岛素钳夹技术Effbcts of vi sfati n geneoverexpressi蚰佣i l l slll i nsesi ti vi钾i IIthe i nsuUnresi stantrats iIl ducedbyhi gllfat di et5嬲7Q汛+，Li昭，蹦G如增一，Ren勘e，日，Q，舡一归，Jsk昭一6i愕，衄E耽凡一伽e，l，uk，烈G K，(枇nkr露。 如几+脚疗，瑚m旷西h面c矗加如gy，砘&c0耐4历fi。 把d日。 班以，Deponmm旷cf饥如oz B幻ckm括打y。 砌舭研如60m幻ry旷k60mto哆胁妣。 f Di昭聊溉溉k嬲i忍西即可尉眦8砌忍，劬。 唧i增胁反Z砌娩强渺，劬o，钟姗4D00J0，班i船corre印。 蒯i增口以危oryAG仇增一yi，E，眦以舭，咖昭妒bnco巩【Abst阳ct】obj ectiveToi nvestigatethe effectsofvi sfati ngeneoverexpressi onon i nsul i nsensi ti vi tyi ni nsul i nresi stant(IR)rats i nducedby hi gh-fatdi etMethod_s Therebi nantvi sfati npl asmid wasconstmctedandt1肌sfected imoIRratsi nducedby hi ghfatdi etTheeugl ycemichype“nsul i nemi l啪p experimentswereperfbnedfor evaluati onthechangeof i nsul i nsensitivitybefore andafteradmi nistrati onResl lIts The expressi onpl asmid ofvi sfati n weresuessful lv constmctedAfter3davsfor plasm主di njecti ng，pl asmavi sfati nl evel s andgl ueosei nfusi on ratesweresi gni矗eantl yi ncreased(219土036vs O98027and32612vs24012mgkg一1mi n一1，respecti vely，a11P001)，andtotal ch01esterol andhi ghdensi tylipoprotei nchol esterol(HDLC)were8i gnifi cantlv decreased(236022vs160021mmoLL and141024vs088011mmoLL，respecti velv，al lP005)i nhighfatdi etratsCd璐ionThe transfection ofvi sfati npl asmidenhancedpl asmavisfatin l eveland improvedi nsulinsensitivityi nIR I-ats inducedbyhighf缸diet。 【Key words】Vi sfatin；Insul in antibodi cs；Eugl ycemichyperi nsu“nemi acl amp基金项目国家自然科学基金资助项目 (30771037)；国家教委春晖计划基金资助项目(xx_56)；重庆市教委科研基金资助项目(j匹0304)；美国NIH基金资助项目(Roi HIJD73267)400010重庆医科大学附属第二医院内分泌科和脂质研究中心(孙勤、杨刚毅、李钶、齐晓亚、李生兵、陈文雯)；检验系临床生化教研室和教育部省部共建重点实验室(李伶、李仁哲)；Depanment ofPedi atrics，uni versity0fMi ssissi ppiMedical center，2500Nonh statestreet，J ackson，Mi ssissi ppim，MS392164505，usA(刘桦)；0nc0109)rRessearch，centocor，Inc，Mal vem，Pennsyl vania，PAl9355，usA(唐毅)；TheDi visi on0fEndocnol ogyDi abetesMetabol i sm andthe Cli nical ResearchCenter，Templ eUni versitySchool ofMedi ci ne，Phi ladel phia，Pennsyl vania，PAl9140，uSA(Guenther Boden)通讯作者杨刚毅，Emai lga“gyi yangyal l00万方数据生堡匡堂盘壶!Q!堡!旦!旦笙竖鲞箜!翅盟!塑鲤g!i些!型!型!塑!，!，盟!近年来随着人们对脂肪组织功能研究的不断深入，已发现它在储存能量的同时，还能分泌多种细胞因子参与复杂的能量代谢和调节过程，并在胰岛素抵抗(IR)的发生发展中起着重要作用1。 内脂素是新近发现的一种脂肪细胞因子，以前被称为前B细胞克隆增强因子(PBEF)，目前发现它可与胰岛素受体结合，具有类胰岛素作用使血糖降低。 但其是否改善IR尚无定论。 本研究构建了大鼠内脂素基因重组真核表达质粒，将其导人高脂喂养的IR大鼠体内，并首次采用两次正糖高胰岛素钳夹技术比较了内脂素表达载体导人前后高脂大鼠胰岛素敏感性的变化及其对脂代谢的影响。 材料与方法 一、材料4周龄健康雄性SD大鼠13只随机分为实验组(8只)和对照组(5只)，适应性喂养1周后给予高脂饲料(营养成分蛋白质12，脂肪55，碳水化合物33)饲养16周。 大肠杆菌EcD尻D历“为本室保存；真核表达载体pcDNA31(+)和Tri z01为美国Invi trogen公司产品；反转录酶MMLV、DNA聚合酶Pri meSTARlM HSDNA P01ymerase、限制性内切酶EcoR I和Xhol I、T4DNA连接酶为大连TakaTa公司产品；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒为华舜公司产品；去内毒素质粒大量提取试剂盒为美国omega公司产品；羊抗鼠内脂素多克隆抗体为美国santa cmz产品；HRP标记的兔抗羊二抗为北京中杉金桥产品；化学发光试剂盒为上海康成公司产品。 二、方法1真核表达载体pcDNA31内脂素的构建取sD大鼠的新鲜内脏脂肪组织提取总RNA，以此RNA为模板逆转录合成cDNA第一链。 根据大鼠内脂素基因的cDNA序列设计引物。 上游5GcGAATTCGCCACCATGAATGCTGCGGCAGAAGC37下游5GCCTCGAGCTAGTGAGGCGCCACATCCT3，PCR扩增。 EcoR I、xhol I双酶切PCR产物和pcDNA31(+)，琼脂糖凝胶电泳纯化，按31混合双酶切后的目的片段和pcDNA31(+)质粒，T4连接酶4连接16h。 连接产物转化DH5仅感受态菌，接种于含氨苄青霉素的琼脂平板上371216h，挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的IJ3液体培养基中振摇过夜，小量提取质粒，分别经双酶切和测序鉴定。 用去内毒素质粒抽提试剂盒大量提取备用。 2导管植入及胰岛素钳夹术大鼠禁食810h后行苯巴比妥(50mkg)腹腔麻醉，经右颈外静脉植入一硅胶导管，延伸到右心房。 颈动脉导管由25cm和10cm长的两段聚丙烯和聚乙烯导管相连，经左侧颈动脉植入达主动脉弓，导管体外部分未端用不绣钢针封闭，用标准伤夹固定于颈背部皮肤。 大鼠术后适应性饲养3d，空腹12h后行胰岛素钳夹术。 术中允许大鼠在笼内自由活动。 用肝素盐水冲洗导管后，用三通阀连接动脉导管，用两个微电脑数字式微量注射泵由颈动脉输注25葡萄糖和胰岛素。 钳夹开始后，以6mukgmi n。 的速度连续输注胰岛素，每5l omi n测定血糖浓度，并调节25葡萄糖输注率(GIR)将血糖维持在6mmoLL左右。 分别于钳夹前后从颈静脉导管抽取血液标本，并用同窝大鼠血补充血容量。 2。 第一次钳夹术结束后，实验组大鼠于股四头肌注射重组质粒pcDNA31(+)内脂素03mg，对照组注射空载体pcDNA31(+)O3mg，于质粒注射3d后行第二次钳夹术，方法同第一次钳夹术。 3Westem印迹测定血清内脂素蛋白水平取血浆05斗1加09NaCl和5上样缓冲液至25斗1，煮沸5mi n，取20恤l行聚丙烯酰胺凝胶电泳。 将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上，封闭过夜，与一抗羊抗鼠内脂素多克隆抗体反应，洗涤后与HRP标记的兔抗羊二抗反应，然后按试剂盒操作说明进行化学发光反应。 用图象扫描软件以质粒注射前血浆基础内脂素的条带灰度为l，比较各条带灰度值。 4其他指标的测定血浆胰岛素用放射免疫分析试剂盒测定，血浆游离脂肪酸(FFA)及甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLc)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)用酶法测定。 5统计学处理各项数据资料以面s表示，组内比较采用配对检验，数据处理采用sAs8o软件。 结果1真核表达载体pcDNA31内脂素的构建PCR扩增大鼠脂肪组织内脂素基因见图1。 限制性内切酶EcoR I和xh0I双酶切质粒pcDNA31内脂素DNA。 结果显示酶切条带为5428bp和1476bp的两个片段，分别代表质粒pcDNA31(+)和插入目的片段，与预期结果完全一致。 这说明内脂素基因已经正确地克隆到pcDNA31(+)载体上(图2)，DNA序列分析也进一步证实了内脂素基因的正确插入。 2血浆内脂素水平改变实验组及对照组血万方数据空堡匡堂苤查!Q!生!旦!旦筮!鲞箜!塑堕型丛鲤幽些兰!坐!型i，；螋!丛!盟!垒表1pcDNA31内脂素质粒处理前后实验室指标变化(元s)对照组5092O19O90O22221O26198O24138022119037O83015090土O141200，17115O30实验组8O90O21O86012236022160O2114lO24O88O1l O76O17O50O09116O18125015注GIR葡萄糖输注率，TG甘油三酯，Tc总胆固醇，HDLc高密度脂蛋白胆固醇，LDLc低密度脂蛋白胆固醇，FFA游离脂肪酸，l第一次钳夹后；2第二次钳夹后，与质粒处理前比较4P 2、3均为1476bp内脂素基因图1RTPCR扩增内脂素基因M1kDDNA内参照； 1、 2、 3、4均为pcDNA31内脂素质粒的酶切片段图2pcDNA31内脂素质粒的双酶切鉴定注上条pcDNA31(+)内脂素处理大鼠；下条宅载体处理大鼠；1基础内脂素；2第一次钳夹后内脂素；3第二次钳夹前内脂素；4第二次钳夹后内脂素条带图3大鼠血浆内脂素蛋水、F浆内脂素蛋白westem印迹测定结果见图3。 质粒转染后实验组大鼠血浆内脂素水平明显高于处理前(P 对照组血浆内脂素水平无变化。 3血浆生化及糖代谢指标改变质粒处理前后大鼠基础血浆胰岛素水平及空腹血糖差异无统计学意义。 在质粒处理后3d，胰岛素钳夹中实验组大鼠GIR较注射前明显升高(P001)，两次钳夹中GIR的变化见图4。 pcDNA31内脂素质粒处理后，Tc、HDLc明显F降(均P39持续48h以上而且在检查过程中未发现其他潜在的发热源时LR，40，95凹，12130；体温39。 c且有其他发热源时LR，037；95c，o16085。 对于有语言表达能力的儿童而言，腹痛(LR，63；95c，25160)、背痛(LR，36；95c，2161)、排尿困难、尿频、排尿困难+尿频(LR，2228)以及新发尿失禁(LR，46；95c，2876)均可增加尿路感染的可能性。 (本文李群)万方数据内脂素基因过表达对胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的影响作者孙勤，李伶，杨刚毅，李仁哲，李钶，齐晓亚，李生兵，陈文雯，刘桦，唐毅，Guenther Boden，SUN Qin，LI Ling，YANG Gang-yi，LI Ren-zhe，LI Ke，QIXiao-ya，LI Sheng-bing，CHEN Wen-wen，LIU Hua，TANG Yi，Guenther Boden孙勤,杨刚毅,李钶,齐晓亚,李生兵,陈文雯,SUN Qin,YANG Gang-yi,LI Ke,QI Xiao-ya,LISheng-bing,CHEN Wen-wen(重庆医科大学附属第二医院内分泌科和脂质研究中心,400010)，李伶,李仁哲,LI Ling,LI Ren-zhe(重庆医科大学附属第二医院检验系临床生化教研室和教育部省部共建重点实验室,400010)，刘桦,LIU Hua(Department ofPediatrics,University ofMississippi MedicalCenter,2500North StateStreet,Jackson,Mississippim,MS39216-4505,USA)，唐毅,TANG Yi(OneologyRessearch,Centocor,Inc.,Malvern,Pennsylvania,PA19355,USA)，GuentherBoden,Guenther Boden(The Divisionof Endocrinology/Diabetes/Metabolism andtheClinical ResearchCenter,Temple UniversitySchool ofMedicine,Philadelphia,Pennsylvania,PA19140,USA)刊名中华医学杂志英文刊名NATIONAL MEDICALJOURNAL OFCHINA年，卷(期)xx,88 (6)被引用次数1次参考文献(8条)1.Trayhum P;Beattie JHPhysiological roleof adiposetissue:white adiposetissue asall endocrineandsecretory organ外文期刊xx (3)2.Li L;Yang G;Li QHigh-fat-and lipid-induced insulinresistance inrats:the parisionof glucosemetabolism,plasma resistinand adiponectinlevels外文期刊xx (6)3.Fukuhara A;Matsuda M;Nishizawa MVisfatin:a proteinsecreted byvisceral fatthat mimicstheeffects ofinsulin外文期刊xx (5708)4.Kralisch S;Klein J;Lossner UHormonal regulationof thenovel adipoeytokinevisfatin in3T3-L1adipocytes外文期刊xx (3)5.Segawa K;Fukuhara A;Hosogai NVisfatin inadipocytes isupregulated byhypoxia throughHIF1-dependent mechanism外文期刊xx 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