金菩嘉FISH技术.doc

第三节 FISH技术 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）技术是生物学领域的一项技术，广泛的应用于临床诊断、细胞遗传学研究、竞争性整组DNA杂交试验，以及基因图谱绘制中。因本书主要介绍病理技术，所以首先要讲述一下FISH在病理诊断中的应用。特别是在实体瘤方面，HER-2/neu基因探针已经得到了广泛的应用。1998年美国政府FDA批准了作为基因治疗的一种单克隆抗体Herceptin，可配合化疗来治疗部分按期转移性乳腺癌病人，约25%-30%的乳腺癌病人有HER-2/neu肿瘤基因的放大或过度表达，这部分人适合Herceptin治疗。在下文的实验操作中，我们将重点介绍HER-2基因的FISH操作。一、FISH原理FISH技术的原理是利用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。二、乳腺石蜡切片FISH操作步骤方法1、实验试剂（1）20SSC（pH5.3）：氯化钠88g，柠檬酸钠44g，去离子水400mL充分溶解。室温下12mol/L HCl调节PH值至5.3，用去离子水定容至500mL，高压灭菌，使用期间2-8储存，保存期不要超过6个月。（2）2SSC(pH7.00.2)：20SSC(PH5.3)100mL，去离子水800mL,充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.00.2，用去离子水定容至1L。使用期间2-8储存，保存期不要超过6个月。（3）变性液：甲酰胺35mL，20SSC(PH5.3)5 mL充分混匀，室温下调节PH值至7.0-8.0，用去离子水定容至50mL，使用期间2-8储存。（4）甲酰胺洗涤液：甲酰胺75mL，20SSC(PH5.3)15 mL充分混匀，室温下调节PH值至7.0-8.0，用去离子水定容至150mL，使用期间2-8储存。（5）30%(W/V)酸性亚硫酸钠：15g酸性亚硫酸钠溶于40mL去离子水中，轻轻摇动至完全溶解，加去离子水定容至50mL。（6）蛋白酶K储存液（20mg/mL）：0.1g蛋白酶K干粉溶于5mL2SSC(pH7.0)溶液中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解，-20分装储存。 蛋白酶K工作液（200ug/mL）：取0.4 mL蛋白酶K储存液（20mg/mL）溶于40mL 2SSC(pH7.0)溶液中。（7）0.1%NP-40/2SSC洗液：20SSC（pH5.3）40mL，NP-40 0.4mL，去离子水300mL充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.00.2，去离子水定容至400mL。使用期间2-8储存，保存期不要超过6个月。 2、操作步骤 预处理程序：（1）样本的制备：10%中性福尔马林固定，石蜡包埋组织，切片厚度为4m。（2）将组织粘附于经硅化处理的载玻片上，80烤片机烤片30分钟以上，放入65烤箱烤片过夜，使组织切片更紧的粘附在玻片上防止脱片。（3）脱蜡：二甲苯10分钟2； 5分钟1，随后浸入100%乙醇中5分钟。（4）将切片依次置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各两分钟，随后浸入去离子水中3分钟，吸取多余水分。（5）50，30%(W/V)酸性亚硫酸钠处理20-30分钟。（6）于2SSC溶液中漂洗2次，每次 5分钟。（7）将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37下孵育10-30分钟。（8）于2SSC溶液中漂洗2次，每次 5分钟。（9）将切片置于0.1M HCl中室温浸泡5-10分钟，于2SSC溶液中漂洗2次，每次 5分钟，将切片置于-20预冷的70%、85%、100%乙醇中各2分钟脱水。（10）将切片室温浸入丙酮溶液中2分钟，自然干片。（11）56，烤片2-5分钟。标本准备及变性（12）将盛有变性液的容器置于731水浴箱中约30分钟，使溶液达到所需温度，将玻片在变性液中浸泡5分钟。（13）将玻片依次置于预冷的70%、85%、100%乙醇中各3分钟进行梯度脱水。玻片自然干燥后，置于45-50烤片机上预热2-5分钟后与探针杂交。探针混合物准备及变性（14）将7l杂交缓冲液、1l去离子水、2l探针加入到微量离心管中，离心1-3秒，涡旋混匀后再次短暂离心。（15）装有探针混合物的试管置于731水浴箱中变性5分钟之后，将该试管置于45-50水浴箱中，杂交前取出。探针与样本杂交（16）将10uL变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。（17）将玻片置于预热的湿盒中，42保温箱中过夜杂交。玻片洗涤（18）461，50%甲酰胺/2SSC溶液 10分钟3(pH7.0-8.0)（19）461，2SSC 10分钟(pH7.0)（20）461，0.1%NP-40/2SSC，5分钟(pH7.00.2)（21）室温，70%乙醇3分钟（22）暗处自然干燥玻片（23）室温，将15ulDAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片(DAPI自冰箱取出平衡到室温后轻弹混匀)（24）暗处放置10-20分钟，在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察玻片（所用不同荧光染料的激发光和发射光波长及滤光镜选择见如下附表）（25）结果判定： 探针：包括HER2和17号染色体，17号染色体为内对照，标记颜色为红和绿结果判断：计数30个细胞，统计Ratio值（Ratio值=30个细胞核中HER2信号总数/30个细胞核中17号染色体信号总数）。Ratio值2.2为阳性结果，提示样本中HER2基因发生扩增；Ratio值在1.8-2.2之间时，可以选择增加计数细胞至100个，或重做FISH实验来判断最终结果，如下图：图4-07该样本Ratio值2.2为阳性结果 结果分析注意事项：计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞；杂交不均匀的区域不要分析；细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析；背景深影响信号判断的区域不要分析；计数结果需有两个参与人员独立完成，结果一致方可认定；分析石蜡切片时，分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位；如果超过25%的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析；如果超过10%的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。FISH技术已经广泛的运用到分子病理技术中，除乳腺癌中Her-2基因的检测外，套细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma, MCL)也可以通过FISH技术与其他淋巴瘤做鉴