《食品微生物学》实验指导书.doc

食品微生物学 课程课程编号：419005实 验 指 导 书 主撰人 曾 智 审核人 陈跃进单位：生命科学系 二O一二 年 六 月目 录前言1实验一、显微镜油浸系物镜的使用与微生物形态观察3实验二、细菌的革兰氏染色6实验三、微生物细胞大小测定和浓度测定8实验四、培养基的制备与灭菌12实验五、环境中微生物的检测17实验六、水中细菌总数检测20前 言1 实验总体目标 微生物学实验课是一门操作技能较强的课程。通过本课程的学习，要求学生牢固地建立无菌概念，掌握微生物实验的一套基本操作技术；树立严谨、求实的科学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力；树立勤俭节约、爱护公物、相互协作的优良作风。 适用专业年级 生物技术专业二年级第一学期 实验课时分配 24实验项目实验要求实验类型每组人数实验学时实验一 显微镜油浸系物镜的使用与微生 物形态观察必验证24实验二 细菌的革兰氏染色必验证24实验三 微生物细胞大小测定和浓度测定必综合24实验四 培养基的制备与灭菌必综合24实验五 环境中微生物的检测必验证24实验六 水中细菌总数检测必综合244. 实验环境 在微生物学及发酵工程分室中进行，要求至少提供8套可用的仪器设备，分析天平1台，离心机1台，分光光度计1台，恒温水浴3台，高压蒸汽灭菌锅2台，超净工作台3台，恒温摇床2台，恒温培养箱2台，干燥箱1台，冰箱1台。实验室面积60 M2以上，通风、照明设施良好，消防设备齐全，疏散通道正常。5. 实验总体要求通过本实验课程的教学，学生能基本上达到独立完成实验内容，通过老师的指导可完成研究性实验内容，能将微生物菌种分离与鉴定、无菌操作等相关知识应用到课程设计、创新性研究、毕业论文等实践性环节中。6. 本课程的重点、难点及教学方法建议（1）重点：无菌操作、微生物分离与鉴定等。（2）难点：严格按照微生物实验操作要求进行各项实验，并理解各注意事项的原因。（3）教学方法建议：注意理论与实际相结合，重视动手能力的培养和锻炼，对实验结果的可靠性进行对照分析和检测分析。对理论性较强、较为抽象的问题、原理着重讲解，如革兰氏染色法的原理和应用。22实验一 显微镜油浸系物镜的使用与微生物形态观察1、 实验目的 掌握显微镜低倍镜和高倍镜的使用方法，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。2、 实验主要设备及材料 微生物标本装片，香柏油，二甲苯，光学显微镜，擦镜纸。3、 实验原理、方法和手段油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55m。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42m；而使用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22m。光学显微镜的成像原理（倒立的虚像） 介质为空气与介质为香柏油时光线通过的比较 4、 实验内容与步骤（一）观察前的准备1、将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约4cm。坐正后用左眼观察。2、调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。（二）低倍镜观察染色装片 首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。（三）高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。（四）油镜观察1、提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。2、从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。3、将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反方向旋转），当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。4、再次观察 提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。（五）镜检完毕后的工作1、移开物镜镜头。2、取出装片。3、清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。4、擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。5、 思考题1、 使用油镜应特别注意哪些问题？为什么必须用香柏油？2、 使用显微镜绘图时，眼睛的位置应该如何？3、 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？4、转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？6、 注意事项及其它说明1、 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2、 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。3、 下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。4、 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。使用油镜后，及时用二甲苯清洁油镜和载玻片。注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。5、 注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。6、 显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。实验二 细菌的革兰氏染色 一、实验目的 学习并掌握细菌的革兰氏染色，了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、实验主要设备及材料 菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli） 试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。三、实验原理、方法和手段 革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。四、实验内容与步骤1、细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。2、制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。3、初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。4、媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。5、脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中最关键的一步。6、复染：滴加番红液，染色2min，水洗。7、用滤纸吸干，油镜镜检。五、思考题 影响革兰氏染色结果的最关键的因素是什么？六、注意事项及其它说明为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不宜过热，脱色时间的控制。另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。实验三 微生物细胞大小测定和浓度测定 一、实验目的 了解测量微生物大小的原理；学习并掌握接目镜测微尺的校正方法及微生物大小的测定方法，增强微生物细胞大小的感性认识。 学习并掌握血球计数板计数的原理；掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。2、 实验主要设备及材料 菌种：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬液。 仪器或其他用具：显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片。 其它：显微镜、血球计数板、手动计数器、擦镜纸、吸水纸等。三、实验原理、方法和手段 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和目镜测微尺。镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm，被等分为100格，每格0.01mm（即10m）。镜台测微尺不直接用来测量细胞的大小。目镜测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将目镜测微尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专用的目镜，里面已经安放好了目镜测微尺。由于目镜测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用目镜测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。该方法是将菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间容积一定的计数室中，在显微镜下进行计数，然后根据计数结果计算单位体积内的微生物总数目。血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。常见血球计数板的计数室有两种规格：一种是1625型，即计数室共分为16个中方格，每个中方格又分为25个小方格；另一种是2516型，即计数室先被分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。但无论是哪一种规格的血球计数板，其计数室的小方格都是400个。我们采用的是2516型。计数时，通常数5个中方格的总菌数，再换算成1ml菌液中的总菌数。计算公式：1ml菌液中总菌数5104 AB（A为5个中方格中的总菌数，B为稀释倍数）4、 实验内容与步骤（一）微生物细胞大小测定1、装目镜测微尺：取下显微镜的目镜，换上专用目镜。如果没有专用的目镜，则取下显微镜的目镜，旋下透镜，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜的隔板上，再旋上目镜透镜，将装有测微尺的目镜装回镜筒。2、目镜测微尺的标定： （1）放镜台测微尺：将镜台测微尺刻度面朝上固定在显微镜的载物台上，注意不可放反。（2）标定：将低倍镜转入光路，镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度相平行。利用移动钮移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。（使目镜测微尺的一条刻度线与镜台测微尺的一条刻度线相重合，再寻另一重合线，分别数出其间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数）（3）用同样的方法，分别在高倍镜和油镜下对目镜测微尺进行标定。（观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度，换高倍镜和油镜标定时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头）（4）计算：已知镜台测微尺每格长10m，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（m）=10n/m n：两重合线间镜台测微尺格数m：两重合线间接目测微尺格数3、微生物细胞大小的测量目镜测微尺标定完毕后，取下镜台测微尺，换上微生物标本片，将其固定在载物台上，先用低倍镜找到标本片图象，然后根据不同的微生物对象分别转换到高倍镜或油镜下，用目镜测微尺测量微生物细胞的直径或宽和长所占的格数，再依据所标定的高倍镜或油镜下每一格的实际长度计算细胞的实际大小。通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大小，为了尽量减小实验误差，应在同一标本片上测量1020个细胞，取其平均值作为该菌的大小。（二）微生物细胞浓度测定1、菌悬液的制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母培养物制成浓度适当的菌悬液。2、加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细作用自动进入计数室（注意取样前要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生）。3、找计数室：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数（注意调节显微镜光线强弱，使菌体和计数室线条清晰）。4、显微镜计数：取左上、右上、左下、右下和中央5个中方格进行计数。位于中方格边线上的菌体一般只计上边和右边线上的（或只计左边和下边线上的）。如遇到酵母出芽，芽体大小达到母细胞一半以上时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从上下两个计数室中得到的平均数值来计算样品的含菌量。5、清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察计数室内是否有残留菌体或其它沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、思考题1、根据你的体会，说说用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？2、能否用血球计数板在油镜下对细菌进行计数？为什么？六、注意事项及其它说明测量完毕，换上原有的显微镜目镜（或取出目镜测微尺，目镜放回镜筒），用擦镜纸将测微尺擦拭干净后放回盒内保存，并按照显微镜的使用和维护方法擦拭物镜。 血球计数板使用完毕后及时洗涤，注意不要用尖锐的物体擦拭表面。实验四 培养基的制备与灭菌一、实验目的 掌握常用细菌培养基的配制方法。掌握高压蒸汽灭菌的操作方法。2、 实验主要设备及材料 药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿等。 其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。三、实验原理、方法和手段 正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相同。例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。四、实验内容与步骤（一）玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。（二）液体及固体培养基的配制过程1、液体培养基配制（1）称量：一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基配方计算出各成分的用量然后进行准确称量。（2）溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水），用玻璃棒搅动，加热溶解。（3）定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。（4）调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用PH试纸测试，直至达到所需pH为止。（5）过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。2、固体培养基的配制 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂（1.52）加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。（三）培养基的分装 根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。1、试管的分装取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹佐玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15150 mm时，液体培养基可分装至试管高度14左有为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高15（约34mI），半固体培养基分装量为管高的13为宜。2、三角瓶的分装用于振荡培养微生物时，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液体培养基；若用于制作平板培养基用时，可在250 m1三角瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉（按2计算），灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。（四）棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。1、试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞。然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的23在试管内，13在试管外。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注明培养基的名称称及配制日期，灭菌待用。2、三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。（五）培养基的灭菌培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。（六）斜面和平板的制作1、斜面的制作将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度l2为宜。如制作半团体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至凝固。2、平板的制作将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入1015mL培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。（七）培养基的灭菌检查灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出1-2管(瓶)，置于37温箱中培养1-2天，确定无菌后方可使用。五、思考题1、为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞才能使用？2、配制培养基时为什么要调节pH？3、高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？六、注意事项及其它说明1、加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。2、装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。3、加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。4、排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟。5、升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。6、保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。如本实验中采用0.1Mpa，121.5，20分钟灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。7、降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。8、无菌检查：将已灭菌的培养基放入37恒温培养箱培养24h，检查无杂菌生长后，即可使用。实验五 环境中微生物的检测 一、实验目的 证明实验室环境与体表存在微生物。比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。观察不同类群微生物的菌落形态特征。体会无菌操作的重要性。二、实验主要设备及材料 培养基：肉膏蛋白胨琼脂平板。 仪器或其他用具：无菌水，接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸等。三、实验原理、方法和手段 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养1-2d内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。四、实验内容与步骤1、写标签任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源(如实验室空气或无菌室空气或头发等)，字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。2、实验室细菌检查（1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。lh后盖上两个皿盖。3、人体细菌的检查（1）手指（洗手前与洗手后）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（班级、姓名日期）。移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。（2）头发 在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到玻脂平板表面，然后盖上皿盖。（3）咳嗽 将去皿盖的琼脂平板放在离口约68cm处，对着琼脂表面用力咳嗽（注意是干咳，不要有太大的气流和口水），然后盖上皿盖。4、将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37培养箱，培养12d。五、思考题1、比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？2、人多的实验室与无菌室(或无人走动的实验室)相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？3、洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？4、通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会。六、注意事项及其它说明结果记录方法（1）菌落计数 在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数l/4面积的菌落数。（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。菌落特征描写方法如下：大小：大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准。颜色：黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。干湿情况：干燥、湿润、粘稠。形态： 圆形、不规则等。高度：扁平、隆起、凹下。透明程度：透明、半透明、不透明。边缘：整齐、不整齐。实验六 水中细菌总数检测 一、实验目的 学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。了解水源水的平板菌落计数的原则。2、 实验主要设备及材料 培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基平板，无菌水。 仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，移液枪，灭菌枪头，灭菌试管，灭菌涂布器等。三、实验原理、方法和手段 本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。四、实验内容与步骤1、水样的采取（1）自来水：