CN102165917A一种利用稀土元素提高鱼藤素含量的方法

CN102165917A一种利用稀土元素提高鱼藤素含量的方法 (10)申请公布号102165917A (43)申请公布日xx.08.31102165917A*102165917A* (21)申请号xx10004647.8 (22)申请日xx.01.11A01H4/00(xx.01) (71)申请人福建农林大学地址350002福建省福州市仓山区建新镇金山学区 (72)发明人甘纯玑陈潇彬李坚黄钰洁谢苗 (74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊 (54)发明名称一种利用稀土元素提高鱼藤素含量的方法 (57)摘要本发明提供了一种用稀土元素提高鱼藤素含量的方法。 该方法包括 （1）将鱼藤愈伤组织接种到含0.005mmol/L0.2mmol/L稀土元素或稀土元素氧化物的常规植物细胞培养基上，并添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，0.5mg/L6mg/L细胞分裂素和1mg/L6mg/L细胞生长素,于20C30C下避光培养15d30d； （2）培养后上述同类型的培养基上，于20C30C下避光培养15d50d。 本发明通过将鱼藤的愈伤组织转接至含有稀土元素的培养基中，从而改善鱼藤愈伤组织细胞的生长状况，促进鱼藤细胞生长并提高鱼藤素的积累量。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书5页102165920A1/1页21.一种利用稀土元素提高鱼藤素含量的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤 （1）将鱼藤愈伤组织接种到含0.005mmol/L0.2mmol/L稀土元素或稀土元素氧化物的常规植物细胞培养基上，并添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，0.5mg/L6mg/L细胞分裂素和1mg/L6mg/L细胞生长素,于20C30C下避光培养15d30d； （2）培养后再次接种到含有0.005mmol/L0.2mmol/L稀土元素或稀土元素氧化物的常规植物细胞培养基上，并添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，0.5mg/L6mg/L细胞分裂素和1mg/L6mg/L细胞生长素，于20C30C下避光培养15d50d。 2.根据权利要求1所述的利用稀土元素提高鱼藤素含量的方法，其特征在于所述鱼藤愈伤组织的诱导过程为取鱼藤的外植体，经灭菌消毒后，于无菌条件下接种到常规植物细胞培养基，并添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，2mg/L细胞分裂素和2mg/L细胞生长素，在pH=5.8，25C的条件下离体培养，获得鱼藤愈伤组织。 3.如权利要求2所述的应用稀土元素提高鱼藤素含量的方法，其特征在于所述鱼藤的外植体为鱼藤的根、茎、叶或芽。 4.如权利要求1所述的应用稀土元素提高鱼藤素含量的方法，其特征在于，所述步骤 （1）的稀土元素为Nd、La或Ce，所述稀土元素氧化物为La2O 3、CeO 2、Pr6O11和Sm2O3的混合物，所述的混合物中的各组分的摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=903501028010501050。 5.如权利要求1所述的应用稀土元素提高鱼藤素含量的方法，其特征在于，所述步骤 （2）的稀土元素为Nd、La或Ce，所述稀土元素氧化物为La2O 3、CeO 2、Pr6O11和Sm2O3的混合物，所述的混合物中的各组分的摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=903501028010501050。 6.如权利要求1所述的应用稀土元素提高鱼藤素含量的方法，其特征在于，所述步骤 （1）和步骤 （2）的细胞分裂素为6-苄氨基嘌呤。 7.如权利要求1所述的应用稀土元素提高鱼藤素含量的方法，其特征在于，所述步骤 （1）和步骤 （2）的细胞生长素为2，4-二氯苯氧乙酸。 8.如权利要求1所述的应用稀土元素提高鱼藤素含量的方法，其特征在于，所述步骤 （1）和步骤 （2）的常规植物细胞培养基为MS培养基。 权利要求书102165917A102165920A1/5页3一种利用稀土元素提高鱼藤素含量的方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用稀土元素提高鱼藤素含量的方法。 背景技术0002鱼藤（Derris trifolitaLour）为豆科鱼藤属（Derris Lour）植物，该属植物全世界共有80余种，主要分布于热带及亚热带地区，在中国发现的约有20余种，广泛分布于我国福建、广东、云南、台湾等省。 鱼藤属（Derris Lour）豆科植物如鱼藤（Derris trifolitaLour.），毛鱼藤（Derris elliptica(Roxb.)Benth.），以及灰叶属（Tephrosia Pers）豆科植物非洲山毛豆(Tephrosia vogeliiHook f)等均含有大量的鱼藤酮类化合物，是鱼藤酮类化合物的主要。 0003鱼藤素是鱼藤酮类化合物中的一种，近期研究表明，鱼藤素能够有效地抑制多种癌细胞，特别是肺癌细胞的生长和繁殖，诱导癌变前和癌变细胞的凋亡。 鱼藤素抗癌机理主要有对生物体内广泛存在的DNA拓扑异构酶（DNA Topoisomerase）表达的影响，进而抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡。 目前，鱼藤素的抗癌作用已越来越受到研究者的重视。 0004鱼藤素由于其结构复杂，人工合成成本高、难度大，目前该化合物大多从天然植物中获得且主要从相关植物的根部得到。 在天然植物中，鱼藤素单位面积产量将明显受到植物种类、地域和种植方式的制约，尤其是采集根部后，需要重新培植植株，导致种植周期长，土地利用率低，因此广泛种植鱼藤受到限制，进而限制了鱼藤素的。 0005植物组织培养技术的发展为天然产物的生产提供了广阔的空间。 通过植物细胞离体培养技术生产鱼藤素，可以避免田间栽培所带来的不利因素，节省土地、缩短生产周期、降低成本，而且可以不受外界环境条件的限制，稳定这一产物的，甚至可以进行大规模化的批量生产。 但是鱼藤植物组织培养的研究中常出现鱼藤的愈伤组织生长缓慢、易褐化（褐化率达50%60%）及鱼藤素含量低等问题，在大规模化的生产中，无法获得高效稳定的培养体系无疑会增加生产的成本，因此建立具有高效且稳定的植物细胞培养体系在生产中是非常重要且是必要的。 0006稀土元素是周期系B族中原子序数为 21、39和5771的17种化学元素的统称。 我国是世界上稀土资源最丰富的国家，约占世界总储量的80%。 目前，稀土元素已经应用于几十种农作物，并在一些中草药的种植中得到应用。 除了少量的重稀土元素，如钇等，对植物的生长具有遗传毒性外，大部分的轻稀土元素，如镧、铈、镨、钕等，均有促进植物生长的作用，（方能虎，何友昭，稀土元素的植物生理作用研究激战，稀土，1998，19 （5）66-70）。 适当浓度的稀土元素对植物的生长调控及代谢产物的积累具有促进作用，如:在多种稀土元素的作用下，可明显的提高藏红花的生长状况及藏红花素的积累（王玉春等，稀土元素促进藏红花细胞生长和提高藏红花素含量的方法，申请号:03146096.8），稀土元素甚至可以替代外源激素对雪莲细胞生长和黄酮类合成起到促进作用（Xiaofan Yua al,Biotechnology Letters,xx,24,1889）。 说明书102165917A102165920A2/5页4发明内容0007本发明目的在于提供一种利用稀土元素提高鱼藤素产量的方法，从而克服鱼藤的愈伤组织培养过程中出现的生长缓慢、鱼藤素含量低及容易褐化的缺陷。 0008本发明的具体技术方案如下利用稀土元素提高鱼藤素含量的方法，包括以下步骤 （1）将鱼藤愈伤组织接种到含0.005mmol/L0.2mmol/L稀土元素或稀土元素氧化物的常规植物细胞培养基上，并添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，0.5mg/L6mg/L细胞分裂素和1mg/L6mg/L细胞生长素,于20C30C下避光培养15d30d； （2）培养后再次接种到含有0.005mmol/L0.2mmol/L稀土元素或稀土元素氧化物的常规植物细胞培养基上，并添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，0.5mg/L6mg/L细胞分裂素和1mg/L6mg/L细胞生长素，于20C30C下避光培养15d50d。 0009所述鱼藤愈伤组织的诱导过程为取鱼藤的外植体，经灭菌消毒后，于无菌条件下接种到常规植物细胞培养基，并添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，2mg/L细胞分裂素和2mg/L细胞生长素，在pH=5.8，25C的条件下离体培养，获得鱼藤愈伤组织。 所述常规植物细胞培养基为MS培养基。 0010所述步鱼藤的外植体为鱼藤的根、茎、叶或芽。 0011所述步骤 （1）的稀土元素为Nd、La或Ce，所述稀土元素氧化物为La2O 3、CeO 2、Pr6O11和Sm2O3的混合物，所述的混合物中的各组分的摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=903501028010501050。 0012所述步骤 （2）的稀土元素为Nd、La或Ce，所述稀土元素氧化物为La2O 3、CeO 2、Pr6O11和Sm2O3的混合物，所述的混合物中的各组分的摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=903501028010501050。 0013所述步骤 （1）和步骤 （2）的细胞分裂素为6-苄氨基嘌呤。 0014所述步骤 （1）和步骤 （2）的细胞生长素为2，4-二氯苯氧乙酸。 0015所述步骤 （1）和步骤 （2）的常规植物细胞培养基为MS培养基，MS培养基含盐量较大，含有高浓度的硝酸盐、钾离子和铵离子，微量元素种类齐全。 MS培养基的组分和含量为NH4NO3（1650mg/L）;KNO3(1900mg/L)；CaCl2H2O（440mg/L）；MgSO47H2O（370mg/L）；KH2PO4（1700mg/L）；KI（0.83mg/L）；H3BO3（6.2mg/L）；MnSO44H2O（22.3mg/L）；ZnSO47H2O（8.6mg/L）；Na2MoO42H2O（0.25mg/L）；CuSO45H2O（0.025mg/L）；CoCl26H2O（0.025mg/L）；FeSO47H2O（27.8mg/L）；Na2-EDTA2H2O（37.3mg/L）；肌醇（100mg/L）；烟酸（0.5mg/L）；盐酸吡哆醇（0.5mg/L）；盐酸硫胺素（0.5mg/L）；甘氨酸（2mg/L）；本发明通过将鱼藤的愈伤组织转接至含有稀土元素的培养基中，从而改善鱼藤愈伤组织细胞的生长状况，促进鱼藤细胞生长并提高鱼藤素的积累量。 这对今后应用植物细胞工程方法大规模生产鱼藤素提供了基础。 0016利用本发明所提供的方法对鱼藤的愈伤组织进行培养，能使愈伤组织的褐化程度得到明显的降低由加入前的50%60%降低为10%25%，因此直接解决了愈伤组织因褐化而引起的生长缓慢或死亡的问题，能获得比常规方法培养更多的鱼藤细胞的生物量，并说明书102165917A102165920A3/5页5显著提高鱼藤素的含量。 具体实施方式0017以下结合实施例说明本发明的具体实施过程，但是本发明不仅限于此。 0018实施例 1、用自来水洗净鱼藤叶片表面的泥土、灰尘等，用蒸馏水冲洗23次，滤纸吸干表面水分，用75%酒精浸泡30秒钟，用无菌水漂洗23次，使用2%的次氯酸钠溶液浸泡消毒6分钟，再用无菌水洗涤58次，用无菌滤纸吸干叶片表面的水分，用灭菌打孔器将叶片切成约一平方厘米的小片，分别接种于添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，含0.5mg/L细胞分裂素和2mg/L细胞生长素的MS植物培养基上（MS培养基是目前使用最普遍的培养基。 其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长），放置于25C培养箱中避光培养2030天后进行继代，经过3次继代培养，每次培养2030天，可获得鱼藤叶片愈伤组织。 0019将所获得的鱼藤叶片愈伤组织接种到含有0.01Mm La的MS植物细胞培养基上，每升培养基添加2mg细胞分裂素和5mg细胞生长素，于20C培养箱中避光培养30天，获得15g/L的愈伤组织。 将此愈伤组织转接到含有0.05mM Ce的MS植物细胞培养基上，每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，2mg/L细胞分裂素和1mg/L细胞生长素，在25C培养箱中避光培养50天。 使用HPLC（高效液相色谱）测定鱼藤愈伤组织中鱼藤素的含量，测定方法参照曾鑫年，张善学等（Modification ofthe analyticalmethod forrotenoids inplantsChin JChromatography(色谱)，xx，xx4-147）所使用的方法，测得该愈伤组织中鱼藤素的含量为1.21%，w/w，褐化率为25%。 0020在同样条件下，不加稀土元素的对照组，愈伤组织生物量为9g/L，鱼藤素含量仅为0.45%（w/w），而有55%的愈伤组织出现了褐化现象。 可以看出本发明培养的愈伤组织与对照组相比，褐化率下降了30%，生物量提高66%，鱼藤素含量提高170%。 0021实施例 2、将实施例1中得到的鱼藤叶片经诱导并继代3次所获得的愈伤组织接种到含0.005mM La的MS植物细胞培养基中,每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，6mg/L细胞分裂素和6mg/L细胞生长素，于25C培养师内培养15天，与不加稀土元素的对照组相比,获得的愈伤组织提高30%，而褐化率降低了35%。 将培养后的愈伤组织转接到含有0.01mM Ce的MS植物细胞培养基上，每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，0.5mg/L细胞分裂素和4mg/L细胞生长素，在25C培养箱中避光培养35天，与不加稀土元素的对照组相比,愈伤组织褐化减少27%，鱼藤素的含量提高166%。 0022实施例 3、将实施例1中得到的鱼藤叶片经诱导并继代3次所获得的愈伤组织接种到含0.02mM混合稀土元素（其组成比与摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=90:120:1035）的MS植物细胞培养基中每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，3mg/L细胞分裂素和3mg/L细胞生长素，于30C培养师内培养30天，与不加稀土元素的对照组相比,愈伤组织褐化减少38%获得的愈伤组织提高45%。 将此愈伤组织转接到含有0.05mM Ce的MS植物细胞培养基上，每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，1mg/L细胞分裂素和4mg/L细胞生长素，在20C说明书102165917A102165920A4/5页6培养箱中避光培养25天，与不加稀土元素的对照组相比,愈伤组织褐化减少50%，鱼藤素的含量提高150%。 0023实施例 4、将实施例1中得到的鱼藤叶片经诱导并继代3次所获得的愈伤组织接种到含0.05mM混合稀土元素（其组成比与摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=350:10:1010）的MS植物细胞培养基中每升培养基添加2mg/L细胞分裂素和1mg/L细胞生长素，于30C培养师内培养20天，与不加稀土元素的对照组相比愈伤组织褐化减少30%获得的愈伤组织提高25%。 将此愈伤组织转接到含有0.01mM Ce的MS植物细胞培养基上，每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，1mg/L细胞分裂素和4mg/L细胞生长素，在28C培养箱中避光培养20天，与不加稀土元素的对照组相比愈伤组织褐化减少25%,鱼藤素的含量提高130%。 0024实施例 5、将实施例1中得到的鱼藤叶片经诱导并继代3次所获得的愈伤组织接种到含0.2mM混合稀土元素（其组成比与摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=90:280:5025）的MS植物细胞培养基中每升培养基添加2mg/L细胞分裂素和1mg/L细胞生长素，于30C培养师内培养20天，与不加稀土元素的对照组相比愈伤组织褐化减少45%获得的愈伤组织提高35%。 将此愈伤组织转接到含有0.02mM Ce的MS植物细胞培养基上，每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，0.5mg/L细胞分裂素和4mg/L细胞生长素，在25C培养箱中避光培养25天，与不加稀土元素的对照组相比愈伤组织褐化减少40%鱼藤素的含量提高135%。 0025实施例 6、将实施例1中得到的鱼藤叶片经诱导并继代3次所获得的愈伤组织接种到含0.01mM Nd的MS植物细胞培养基中,每升培养基添加3mg/L细胞分裂素和2mg/L细胞生长素，于25C培养师内培养25天，与不加稀土元素的对照组相比愈伤组织褐化减少27%获得的愈伤组织提高45%。 将此愈伤组织转接到含有0.01mM Ce的MS植物细胞培养基上，每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，6mg/L细胞分裂素和4mg/L细胞生长素，在25C培养箱中避光培养35天，与不加稀土元素的对照组相比愈伤组织褐化减少36%鱼藤素的含量提高186%。 0026实施例 7、将实施例1中得到的鱼藤叶片经诱导并继代3次所获得的愈伤组织接种到含0.2mM混合稀土元素（其组成比与摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=350:280:1050）的MS植物细胞培养基中每升培养基添加3mg/L细胞分裂素和6mg/L细胞生长素，于30C培养师内培养20天，与不加稀土元素的对照组相比，愈伤组织褐化减少35%获得的愈伤组织提高35%。 将此愈伤组织转接到含有0.05mM Ce的MS植物细胞培养基上，每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，1mg/L细胞分裂素和6mg/L细胞生长素，在22C培养箱中避光培养25天，与不加稀土元素的对照组相比，愈伤组织褐化减少45%鱼藤素的含量提高115%。 0027实施例 8、将实施例1中得到的鱼藤叶片经诱导并继代3次所获得的愈伤组织接种到含0.1mM混合稀土元素（其组成比与摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=50:200:1010）的MS植物细胞培养基中每升培养基添加6mg/L细胞分裂素和1mg/L细胞生长素，于30C培养师内培养30天，与不加稀土元素的对照组相比，愈伤组织褐化减少39%，获得的愈伤组织比不加稀土说明书102165917A102165920A5/5页7元素的对照组提高65%。 将此愈伤组织转接到含有0.2mM混合稀土元素（其组成比与摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=350:280:10:10）的MS植物细胞培养基中每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，6mg/L细胞分裂素和1mg/L细胞生长素，在28C培养箱中避光培养30天，与不加稀土元素的对照组相比，愈伤组织褐化减少29%鱼藤素的含量提高185%。 0028实施例 9、将实施例1中得到的鱼藤叶片经诱导并继代3次所获得的愈伤组织接种到含0.1mM混合稀土元素（其组成比与摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=90:280:5030）的MS植物细胞培养基中每升培养基添加6mg/L细胞分裂素和1mg/L细胞生长素，于30C培养师内培养30天，与不加稀土元素的对照组相比，愈伤组织褐化减少29%，获得的愈伤组织提高65%。 将此愈伤组织转接到含有0.2mM混合稀土元素（其组成比与摩尔比为La2O3CeO2Pr6O11Sm2O3=90:10:5010）的MS植物细胞培养基中每升培养基添加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，6mg/L细胞分裂素和6mg/L细胞生长素，在20C培养箱中避光培养30天，鱼藤素的含量比不加稀土元素的对照组提高135%，愈伤组织褐化减少44%。 0029实施例 10、将实施例1中得到的鱼藤叶片经诱导并继代3次所获得的愈伤组织接种到含0.1mM混合稀土元素（其