CN103876242A一种抗食源性致病菌的微胶囊及其制备方法和用途

CN103876242A一种抗食源性致病菌的微胶囊及其制备方法和用途 (10)申请公布号103876242A (43)申请公布日xx.06.25103876242A (21)申请号xx10128729.7 (22)申请日xx.04.01A23L3/3472(xx.01)A61K47/46(xx.01) (71)申请人广东工业大学地址510006广东省广州市番禺区广州大学城外环西路100号广东工业的大学工学四号馆706室 (72)发明人赵肃清彭超吴盼盼陈兰英余倩秦静杨灵珊 (74)专利代理机构广州市越秀区海心联合专利代理事务所(普通合伙)44295代理人黄为 (54)发明名称一种抗食源性致病菌的微胶囊及其制备方法和用途 (57)摘要本发明公开了一种抗食源性致病菌的微胶囊及其制备方法，旨在提供一种能有效抑制食源性菌，稳定性好，提高贮存过程中精油稳定性的，安全无副作用抗食源性致病菌的微胶囊；所述的食源性致病菌的微胶囊山以葵精油和橄榄油作为囊芯，以带天然食用胶为囊壁，复合凝聚，并用固化剂京尼平进行固化制成；属于抗菌技术领域。 (51)Int.Cl.权利要求书1页说明书8页附图5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图5页 (10)申请公布号103876242A103876242A1/1页21.一种抗食源性致病菌的微胶囊，其特征在于，所述的食源性致病菌的微胶囊山以葵精油和橄榄油作为囊芯，以天然食用胶为囊壁，经复合凝聚后，用固化剂京尼平进行固化制成。 2.根据权利要求1所述的抗食源性致病菌的微胶囊，其特征在于，所述的囊芯与囊壁的质量比为11。 3.根据权利要求1所述的抗食源性致病菌的微胶囊，其特征在于，所述的山葵精油是山葵的提取物，占囊芯质量的5%。 4.根据权利要求1所述的抗食源性致病菌的微胶囊，其特征在于，所述的天然食用胶为是明胶和阿拉伯胶按质量比11混合而成的混合物。 5.根据权利要求4所述的抗食源性致病菌的微胶囊，其特征在于，所述的明胶为两性B型明胶，其等电点为4.5-5.5。 6.权利要求1所述的抗食源性致病菌的微胶囊的制备方法，其特征在于，依次包括下述步骤1）提取山葵精油新鲜山葵经风干后至恒重，粉碎过20-50目筛，粉碎加入去离子水，以二氯甲烷为萃取溶剂，同时蒸馏萃取3-7h，取二氯甲烷相烧瓶冷却，加入无水硫酸钠固体除水过滤，并在旋转蒸发仪上蒸干溶剂得到棕黄色精油，经0.22m微孔滤膜过滤2-5保存备用；2）精油囊芯与高分子壁材乳化将步骤1）制备的山葵精油与橄榄油配制成质量比1:19的精油囊芯分散液，再质量浓度均为1%的明胶溶液和阿拉伯胶溶液，加入精油囊芯分散液，常温下乳化15min；3）制备含山葵精油的微胶囊将乳化液转移到烧瓶中，调节pH值至4-5，在水浴温度45下保温30min，使乳化液发生凝聚；4）精油微胶囊的固化将步骤3）凝聚后的乳化液调节pH值至8.5-9.5，加入京尼平，在温度0-10搅拌4-6h，使微胶囊囊壁充分固化，固化后的分散液静置抽滤，干燥，即得到山葵精油微胶囊。 7.根据权利要求6所述的抗食源性致病菌的微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的每100g山葵粉末加去离子水1000mL,二氯甲烷的100mL。 8.根据权利要求7所述的抗食源性致病菌的微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤4）中所用的固化剂京尼平与壁材明胶的质量比为0.075g京尼平/mL明胶溶液。 9.根据权利要求7所述的抗食源性致病菌的微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的每克精油囊芯分散液加入明胶溶液体积和阿拉伯胶溶液体积均为50mL。 10.权利要求1所述的抗食源性致病菌的微胶囊作为食品工业，药品工业和纺织品工业的长效防腐剂的应用。 权利要求书103876242A21/8页3一种抗食源性致病菌的微胶囊及其制备方法和用途技术领域0001本发明公开了一种抗食源性致病菌的微胶囊，具体的说，是一种抗食源性致病菌的山葵精油微胶囊及其制备方法，属于抗菌技术领域。 背景技术0002据世界卫生组织估计，全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，70是由于各种致病性微生物污染食品和饮用水引起。 我国过去十年间食物中毒发生情况的统计表明，微生物食物中毒居各类食物中毒病源的首位，约占食物中毒规模的40，导致的中毒人数占总中毒人数的一半以上。 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、大肠杆菌、志贺氏菌、肉毒梭菌、单增李斯特菌等都是重要的食源性致病菌。 0003防腐剂是食品添加剂中的一种，在食品工业中占有非常重要的地位。 但众所周知的是，部分化学合成的防腐剂能够在体内积累引起中毒，或造成食源性疾病、致癌。 因此从天然产物中提取得到具有抗菌作用的天然低毒防腐剂已成为食品工业中一个热点。 自然界中有很多天然植物及精油具有抑菌作用，例如丁香、牛至和肉桂等。 0004山葵(Wasabia japonica)，系十字花科喜阴性多年生草本植物，原产于日本，我国于20世纪90年代初引种。 山葵的植物组织破坏后，其组织内的硫代葡萄糖苷发生酶解释放出挥发性的异硫氰酸酯(ITCs)而产生独特辛辣风味。 已有研究表明，ITCs具有杀菌、防霉和消灭消化道中寄生虫的作用。 0005精油是植物组织在加热过程中产生的一种挥发性油，在有氧、光照、湿度及温度较高时化学性质不稳定，在贮存过程中极易损失，大大限制了其在食品工业中的应用。 发明内容0006针对上述问题，本发明的目的在于提供一种能有效抑制食源性菌，稳定性好，提高贮存过程中精油稳定性的，安全无副作用抗食源性致病菌的微胶囊，本发明还提供该微胶囊的制备方法。 0007为此，本发明提供的前一技术方案是这样的该抗食源性致病菌的微胶囊，所述的食源性致病菌的微胶囊山以葵精油和橄榄油作为囊芯，以天然食用胶为囊壁，经复合凝聚后，用固化剂京尼平进行固化制成。 0008上述的抗食源性致病菌的微胶囊，所述的囊芯与囊壁的质量比为11。 0009进一步的，上述的抗食源性致病菌的微胶囊，所述的山葵精油是山葵中的提取物，占囊芯质量的5%。 0010进一步的，上述的抗食源性致病菌的微胶囊，所述的天然食用胶是明胶和阿拉伯胶按质量比11混合而成的混合物。 0011进一步的，上述的抗食源性致病菌的微胶囊，所述的明胶为两性B型明胶，其等电点为4.5-5.5。 0012本发明的后一技术方案是提供该抗食源性致病菌的微胶囊的制备方法，该方法依说明书103876242A32/8页4次包括下述步骤00131）提取山葵精油0014新鲜山葵经风干后至恒重，粉碎过20-50目筛，粉碎加入去离子水，以二氯甲烷为萃取溶剂，同时蒸馏萃取3-7h，取二氯甲烷相烧瓶冷却，加入无水硫酸钠固体除水过滤，并在旋转蒸发仪上蒸干溶剂得到棕黄色精油，经0.22m微孔滤膜过滤2-5保存备用；00152）精油囊芯与高分子壁材乳化0016将步骤1）制备的山葵精油与橄榄油配制成质量比1:19的精油囊芯分散液，再质量浓度均为1%的明胶溶液和阿拉伯胶溶液，加入精油囊芯分散液，常温下乳化15min；00173）制备含山葵精油的微胶囊0018将乳化液转移到烧瓶中，调节pH值至4-5，在水浴温度45下保温30min，使乳化液发生凝聚；00194）精油微胶囊的固化0020将步骤3）凝聚后的乳化液调节pH值至8.5-9.5，加入京尼平，在温度0-10搅拌4-6h，使微胶囊囊壁充分固化，固化后的分散液静置抽滤，干燥，即得到山葵精油微胶囊。 0021进一步，上述的抗食源性致病菌的微胶囊的制备方法，步骤1）所述的所述的每100g山葵粉末加去离子水1000mL,二氯甲烷的100mL。 0022进一步，上述的述的抗食源性致病菌的微胶囊的制备方法，步骤4）中所用的固化剂京尼平与壁材明胶的质量比为0.075g京尼平/mL明胶溶液。 0023上述的抗食源性致病菌的微胶囊的制备方法，步骤2）所述的每克精油囊芯分散液加入明胶溶液体积和阿拉伯胶溶液体积均为50mL。 0024本发明还有一个技术方案是提供该抗食源性致病菌的微胶囊作为食品工业，药品工业和纺织品工业的长效防腐剂的应用。 0025与现有技术相比，本发明提供的技术方案有如下优点0026 1、以天然环烯醚萜类化合物京尼平苷的水解产物京尼平为固化剂，发明在温和条件下包裹装载具有抗食源性致病菌的山葵精油，得到装载高活性山葵精油的复合凝聚微胶囊，保护精油免遭外界环境的影响与破坏，且在高温度高湿度等不利贮存条件下，有效保护精油受高温和水分的影响，并且缓慢释放出山葵精油中能够高效杀菌的挥发性成分，阻碍细菌的生长于复制，具有安全无副作用，高效低成本的特点。 0027 2、本发明提供的山葵精油微胶囊能有效抑制食源性致病菌的生长，稳定性好。 0028 3、本发明提供的山葵精油微胶囊无毒副作用，精油囊芯对病菌有高效杀灭性，且本身是从天然产物山葵中提取得到；囊壁膜为天然食用胶不仅对环境无危害且易可降解。 0029 4、本发明提供的制备方法是通过改变pH值和温度等较容易实现的条件下下由明胶和阿拉伯胶复合凝聚包裹而成，囊芯为精油，囊壁为水溶性高分子，通过静电吸附而成，而且使用天然产物京尼平作为凝胶的固化剂，使高分子之间稳定结合，通过静电结合的高分子囊壁将不稳定的山葵精油与氧、光照、湿度及较高温度等外部环境隔绝，形成保护作用，在贮存和使用过程中缓慢释放具有抗菌性的精油成分，达到稳定、长效抗菌的效用。 0030 5、本发明提供的山葵精油微胶囊具有良好的缓慢释放特性和极强的抑菌性能，而且与合成防腐剂相比毒性和刺激性较小，适用于食品工业，药品工业和纺织品工业的长效防腐说明书103876242A43/8页5附图说明0031图1是山葵精油的总离子流图；0032图2是山葵精油对几种食源性菌的抑制效果图；0033其中各培养皿中第一排为实验组山葵精油，第二排为溶剂二氯甲烷阴性对照，第三排市售84消毒液为阳性对照，第四排为二甲亚砜阴性对照。 各受试食源性致病菌种为A为金黄色葡萄球菌，B为藤黄八叠球菌，C为表皮葡萄球菌，D为沙门氏菌。 0034图3是微胶囊的形态和粒径分布；0035其中A是微胶囊在荧光显微镜下的分布图片，B是微胶囊的粒径分布图；0036图4扫描电镜下微胶囊表面形态；0037其中a为表面光滑的微胶囊，b为表面粗糙的微胶囊，A为a微胶囊的表面放大，B为b微胶囊的表面放大；0038图5是山葵微胶囊的释放曲线图；0039其中A为在不同相对湿度下的缓释结果，B为在不同温度下的缓释结果。 具体实施方式0040下面结合具体实施方式和附图说明，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。 0041实施例100421）提取山葵精油并检测其化学成分0043取新鲜山葵主茎经风干后至恒重，粉碎过40目筛，取100g粉碎后的样品装入2500mL圆底烧瓶中，再加入1000mL去离子水，圆底烧瓶用电热套加热保持微沸，连接在同时蒸馏萃取仪的物料端。 取100mL二氯甲烷加入到250mL的茄形瓶中，用水浴65加热保持溶剂沸腾，连接在同时蒸馏萃取仪的萃取剂端。 整套装置用冷阱回流，回流温度在5左右。 保持同时蒸馏萃取5h，先关掉电热套和水浴锅，保持30min以后关闭回流冷阱。 待整套装置冷却以后，取二氯甲烷相烧瓶加入1.5g无水硫酸钠固体，静置过夜，用慢速定性滤纸过滤。 之后在旋转蒸发仪上回收二氯甲烷（旋蒸温度设置为35），浓缩得到棕黄色精油，经0.22m微孔滤膜过滤，4保存备用。 0044山葵精油化学成分的检测采用气质联用结合保留指数比对的方法，其分析条件如下0045气相色谱条件色谱柱DB-5MS（30m0.25mm0.25m）毛细管柱；载气He，载气流速为1mL/min（恒流模式）；分流比10l；稀释倍数11000（稀释用溶剂为色谱纯二氯甲烷）；进样量为0.5L；进样口温度250；程序升温条件初始温度40，以3/min升至100，再以5/min升至180，最后以20/min升温至300，并保留1min，总运行时间为41min。 0046质谱条件离子源EI源；电子能量70eV；离子源温度230；四极杆温度150；质量扫描方式为全扫描，扫描范围m/z为33450。 质谱数据运用NISTxx标准谱库进行图谱检索。 说明书103876242A54/8页60047KI值（相对保留指）的测定取正构烷烃（C5-C20）混合对照品，按照上述气相色谱和质谱条件进行分析，记录各正构烷烃保留时间，采用线性升温公式计算山葵精油中各组分的KI值，即KI=100n+100(t x-t n)/(t n+1-t n)，其中t x，t n，t n+1分别为被分析组分和碳原子数目分别处于n和n+1的正构烷烃（其中t n 0048通过气质联用分析得到的山葵精油总离子流图如图1所示，其所对应的化学成分分析如表1所示。 由总离子流图和挥发性成分鉴定结果可知，山葵挥发性成分较为复杂，数量较多，并且各组分之间相对含量差别也很大。 其中以辛辣成分异硫氰酸酯类(ITC s)所占的比例最大，共得到8种异硫氰酸酯，按成分高低排列依次为烯丙基-异硫氰酸酯(相对含量47.94%)，环丙基-异硫氰酸酯(相对含量8.05%)，异丁基-异硫氰酸酯(相对含量5.16%)，正戊基-异硫氰酸酯(相对含量3.42%)，3-（甲硫基）丙基异硫氰酸酯(相对含量1.75%)，正丁基-异硫氰酸酯(相对含量1.24%)，3-丁烯基异硫氰酸酯(相对含量1.6%)，苄基异硫氰酸酯(相对含量0.42%)。 显然，正是由于山葵经水解后能够得到这一类具有刺激性的异硫氰酸酯物质，而使其具有杀菌、消毒的功效，进而被选用为进食海鲜时的调味料。 0049表10050说明书103876242A65/8页7005100522）精油囊芯与高分子壁材乳化0053称取B型明胶10g加入2L大烧杯中，加入990mL去离子水中，放入恒温水浴磁力搅拌器中，加热到60，在磁力搅拌下使其充分溶解，室温冷却，配成质量浓度为1%的明胶说明书103876242A76/8页8溶液备用。 另称取阿拉伯胶10g加入2L大烧杯中，加入990mL去离子水中，放入恒温水浴磁力搅拌器中，加热到70，在磁力搅拌下使其充分溶解，室温冷却，配成质量浓度为1%的阿拉伯胶溶液备用。 0054再称取步骤1）制备的山葵精油0.1g，加入食用橄榄油1.9g，搅拌均匀，加入质量浓度均为1%的明胶溶液和阿拉伯胶溶液各100mL，在高速乳化器下调速至6500r/min进行机械乳化，常温下乳化15min。 00553）制备含山葵精油的微胶囊0056将步骤2）制备的乳化液转移到500mL三口烧瓶中，用1mol/L的醋酸溶液调节pH值为4.4左右，搅拌速度650r/min，在水浴温度45下保温30min，使乳化液发生凝聚。 00574）精油微胶囊的固化0058用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值到9.0左右，加入0.075g京尼平，改用冰水浴，使温度达到0-10，搅拌速度调节为450r/min，在此条件下保持5h，使微胶囊囊壁充分固化。 固化后的分散液静置一段时间，用慢速定性滤纸抽滤浓缩到10mL以内，放入-20冰箱预冻，然后在冷冻干燥仪上-55冻干除去水分，得到山葵精油微胶囊，其囊芯与囊壁的质量比为11。 0059通过荧光显微镜观察其基本外观和激光粒度分散仪检测其粒径分布，参阅图3，由图A的荧光显微镜图片所示，山葵精油微胶囊制备成功，湿微胶囊呈微球状，均匀、连续分散，而由图B的粒径分布统计图可知，在该条件下制得的山葵精油微胶囊粒径主要分布范围是4-10m，且激光粒度仪统计结果表明其平均粒径为6.080m。 0060通过扫描电镜观察其表面形态，参阅图4可知，干燥后的山葵精油微胶囊仍然保持完整球形外观，其中a为表面光滑的微胶囊，A为a微胶囊的表面放大，b为表面粗糙的微胶囊，B为b微胶囊的表面放大，对比图4中各图，表明部分微胶囊形成褶皱状表面，这是由于微球表面的明胶和阿拉伯胶经过多层吸附，形成复合凝聚结构。 0061由于发明提供的山葵精油微胶囊具有良好的缓慢释放特性和极强的抑菌性能，而且与合成防腐剂相比毒性和刺激性较小，适用于食品工业，药品工业和纺织品工业的长效防腐0062为了有效的证明本发明的实验效果，下面给出本发明的验证测试结果。 0063 1、山葵精油的对食源性菌的抑制测试0064采用经典纸片扩散法对山葵精油的抑菌活性进行测试。 首先将金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、表皮葡萄球菌、沙门氏菌共4种供试菌接种于培养皿，37培养1824h，活化2次，用接种环挑取少许活化的菌种以Mueller-Hinton肉汤稀释至0.5麦氏比浊液(1107-1108CFU/mL)菌悬液，再用Mueller-Hinton肉汤培养基稀释100倍，配制成1.5106CFU/mL的菌悬液，备用。 0065取少量山葵精油用二甲基亚砜稀释10倍后备用。 在无菌操作下，吸取100L各供试菌悬液加入含有50mLMueller-Hinton营养琼脂培养基的90mm平板中，均匀涂布。 待菌液晾干以后，取直径为6mm的灭菌滤纸片轻轻压在琼脂平板上，然后移取10L的稀释后的精油轻轻滴加在滤纸片上。 无菌条件下静置片刻后，将培养平板移入培养箱中，在37培养24h后用标尺测定抑菌圈直径大小，以等量的市售84消毒液为阳性对照，以等量的二氯甲烷和二甲基亚砜作为阴性对照。 重复3次，取其平均值。 说明书103876242A87/8页90066参阅图2所示的抑菌实验结果，其中各培养皿中第一排为实验组山葵精油，第二排为溶剂二氯甲烷阴性对照，第三排市售双氧水杀菌剂阳性对照，第四排为二甲亚砜阴性对照。 各受试食源性致病菌种为A为金黄色葡萄球菌，B为藤黄八叠球菌，C为表皮葡萄球菌，D为沙门氏菌。 从图中可以看出，稀释十倍后的山葵精油对各种受试菌都具有很好的抑制作用（抑菌圈直径均大于15mm），其杀菌能力要远强于市售84消毒液（抑菌圈直径在9mm以内），而且其对表皮葡萄球菌的抑制作用最强，平均抑菌圈在19.58mm。 二氯甲烷和二甲亚砜阴性对照基本对细菌无抑制能力。 这说明，山葵精油对一般食源性致病菌具有很强的抑制活性。 0067 2、山葵精油微胶囊在不同贮存环境中的缓释测试0068以山葵精油的最主要成分烯丙基-异硫氰酸酯(相对含量47.94%)的含量来评估精油微胶囊的保留率，而未处理的精油的保留率测量则采用直接称重法。 0069精确称量标准烯丙基-异硫氰酸酯（95%），用己烷溶解，然后配制成 50、 100、 200、 500、1000和2000mol/L的标准溶液。 用配套有氢火焰离子检测器的安捷伦6890气相色谱仪为分析检测仪器。 气相色谱条件色谱柱DB-5MS（30m0.25mm0.25m）毛细管柱；载气He，载气流速为1mL/min（恒流模式）；分流比10l；稀释倍数11000（稀释用溶剂为色谱纯二氯甲烷）；进样量为0.5L；进样口温度250；程序升温条件初始温度40，以3/min升至100，再以5/min升至180，最后以20/min升温至300，并保留1min，总运行时间为41min。 烯丙基-异硫氰酸酯的出峰时间是8.13分钟。 以浓度（C）对检测器测得的峰面积（A）进行线性回归，得到烯丙基-异硫氰酸酯在该条件下的标准曲线方程y=0.06041x-0.18043，R2=0.9995。 0070准确称量0.1g山葵精油微胶囊放置于50毫升的圆底烧瓶中，加入25毫升己烷，在25下磁力搅拌2小时，然后在室温下超声处理10分钟。 随后，将混合物在60的水浴中加热15分钟，并在4下放置过夜，直至完全相分离。 自动进样吸取1L己烷层上机进行气相色谱分析，测