CN101933455A一种普陀樟的离体繁殖方法

CN101933455A一种普陀樟的离体繁殖方法 (10)申请公布号101933455A (43)申请公布日xx.01.05101933455A*101933455A* (21)申请号xx10054352.4 (22)申请日xx.07.03A01H4/00(xx.01) (71)申请人中国科学院上海生命科学研究院地址200031上海市岳阳路320号 (72)发明人朱木兰黄继荣 (74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公司31100代理人陶家蓉 (54)发明名称一种普陀樟的离体繁殖方法 (57)摘要提供了普陀樟离体培养的不定芽诱导、伸长、生根等关键步骤的培养基配方和通过离体培养获得大量普陀樟幼苗的具体方法。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图1页101933455A1/1页21.一种培养基，其特征在于所述培养基含有ML培养基，所述ML培养基含有KNO31200mg/l；NH4NO3825mg/l；MgSO4.7H2O150mg/l；KH2PO4170mg/l；NH4Cl530mg/l；Ca(NO3)22H2O660mg/l；KCl65mg/l；H3BO36.2mg/l；ZnSO47H2O8.6mg/l；MnSO4H2O22.3mg/l；Na2MoO42H2O0.25mg/l；KI0.83mg/l；CuSO45H2O0.25mg/l；CoCl20.025mg/l；FeSO47H2O27.8mg/l；Na2EDTAH2O37.3mg/l；肌醇150mg/l；甘氨酸2.0mg/l；盐酸硫胺0.5mg/l；烟酸0.2mg/l；盐酸吡哆醇0.2mg/l；其中各组分含量可25，还含有生长因子，选自0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤，0.1-0.5mg/l萘乙酸；0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤，0.1-0.5mg/l萘乙酸，和大于0至0.01mg/l的噻二唑苯基脲；大于0至0.6mg/l的6-苄氨基腺嘌呤，大于0至0.06mg/l的萘乙酸和大于0至0.6mg/l的赤霉素；和0.1-0.5mg/l吲哚丁酸。 2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中所含生长因子是0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤，0.1-0.5mg/l萘乙酸。 3.如权利要求2所述的培养基，所述培养基还含有大于0至0.01mg/l的噻二唑苯基脲。 4.如权利要求1所述的培养基，其中所述培养基中所含生长因子是大于0至0.6mg/l的6-苄氨基腺嘌呤，大于0至0.06mg/l的萘乙酸和大于0至0.6mg/l的赤霉素。 5.如权利要求1所述的培养基，所述培养基中所含生长因子是0.1-0.5mg/l吲哚丁酸。 6.一种普陀樟离体幼苗培养方法，其特征在于，该方法包括步骤a)用权利要求2所述的培养基在光照40-80mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为20-28下，从普陀樟上胚轴诱导出原始不定芽；b)用权利要求3所述的培养基在光照40-80mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为20-28下培养所述原始不定芽，使所述原始不定芽生长成不定芽；c)用权利要求4所述的培养基在光照40-80mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为20-28下培养所述不定芽，形成芽苗，再避光培养3-7天，；d)分离单株所述芽苗，剥去小苗形态学下端叶片，用50mg/l吲哚丁酸预处理0-36h后，用权利要求5所述的培养基，其中ML培养基中无机盐浓度减半，加上2-5重量/体积的蔗糖在光照60-100mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为20-28下诱导不定根，得到生根苗；e)将所述生根苗在光照60-100mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为24-32下培养1-2周，在大气下培育5-8天，得到普陀樟幼苗。 7.如权利要求6所述的方法，其中所述上胚轴切段是通过将普陀樟种子置于泥炭、菜园土和珍珠岩，其体积比为721的混合物上，在25-30下培养15-30天使其萌发得到上胚轴，经消毒处理后将所述上胚轴切成2-4mm切段。 8.如权利要求6所述的方法，其中所述步骤a)、步骤b)中是在光照60mol.m-2.s-1，16小时/天，温度为231下培养。 9.如权利要求6所述的方法，其中所述步骤c)中是在光照60mol.m-2.s-1，16小时/天，温度为221下培养。 10.如权利要求6所述的方法，其中所述步骤d)中是在光照80mol.m-2.s-1，16小时/天，温度为241下培养。 权利要求书101933455A1/8页3一种普陀樟的离体繁殖方法技术领域0001本发明涉及植物的培育方法，更具体地说是普陀樟(Cinnamomum japonicumvar.chenii)的培育方法。 背景技术0002普陀樟系樟科(Lauraceae)樟属常绿乔木，间断分布于我国华东地区、朝鲜、日本等东亚一带(丁陈森，1993；张若蕙，1994)。 该树种高大挺拔、材质坚实、纹理优美、耐腐力强；枝叶浓密、冠型饱满、观赏性佳，因而具有很好的商业用材和景观绿化等方面的应用价值(俞慈英等，xx)。 然而，普陀樟的自然株群日渐稀少，1991年被中国植物红皮书稀有濒危植物(第一册)确立为濒危植物(傅立国，1991)，1999年被国家重点保护野生植物名录(第一批)列为国家二级重点保护植物品种(于永福，1999)。 0003xx年自然界尚存普陀樟母树320株，在经济利益的驱动下，周边农民加大了对普陀樟种子的采摘强度，甚至毁树采种，使得普陀樟的濒危状况日益加重。 因此，目前迫切需要一种能够快速培育普陀樟的方法。 发明内容0004发明人为了尽快缓解普陀樟的濒危状况，通过研究离体培养普陀樟幼苗的条件，实现了普陀樟的离体快繁。 因此，本发明的目的是提供一种能够实现普陀樟离体培养的方法。 0005在本发明的一个方面，提供了一种培养基，含有ML培养基，所述ML培养基含有KNO31200mg/l；NH4NO3825mg/l；MgSO4.7H2O150mg/l；KH2PO4170mg/l；NH4Cl530mg/l；Ca(NO3)22H2O660mg/l；KCl65mg/l；H3BO36.2mg/l；ZnSO47H2O8.6mg/l；MnSO4H2O22.3mg/l；Na2MoO42H2O0.25mg/l；KI0.83mg/l；CuSO45H2O0.25mg/l；CoCl20.025mg/lFeSO47H2O27.8mg/l；Na2EDTAH2O37.3mg/l；肌醇150mg/l；甘氨酸2.0mg/l；盐酸硫胺0.5mg/l；烟酸0.2mg/l；盐酸吡哆醇0.2mg/l；其中各组分含量可25；还含有生长因子，选自0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤，0.1-0.5mg/l萘乙酸；0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤，0.1-0.5mg/l萘乙酸，和大于0至0.01mg/l的噻二唑苯基脲；大于0至0.6mg/l的6-苄氨基腺嘌呤，大于0至0.06mg/l的萘乙酸和大于0至0.6mg/l的赤霉素；和0.1-0.5mg/l吲哚丁酸。 0006在该方面的一个优选例中，该培养基所含的生长因子为0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤，0.1-0.5mg/l萘乙酸。 更优选的，所含生长因子为1-2.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/l萘乙酸。 最优选的，所含生长因子为1.75mg/l6-苄氨基腺嘌呤和0.3mg/l萘乙酸。 0007在该方面的另一个优选例中，该培养基所含生长因子除了0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤，0.1-0.5mg/l萘乙酸，还含有大于0至0.01mg/l，更优选为0.005mg/l的噻二唑苯基脲。 说明书101933455A2/8页40008在该方面的还有一个优选例中，该培养基所含生长因子为大于0，至0.6mg/l的6-苄氨基腺嘌呤，大于0，至0.06mg/l的萘乙酸和大于0至0.6mg/l的赤霉素。 0009更优选的，所含生长因子为0.3mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.03mg/l萘乙酸和0.3mg/l赤霉素。 0010在该方面的再一个优选例中，该培养基所含生长因子为0.1-0.5mg/l吲哚丁酸更优选为0.3mg/l吲哚丁酸。 0011在本发明的第二个方面，提供了一种普陀樟离体幼苗培养方法，包括步骤0012a)用上述含有ML培养基和0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤，0.1-0.5mg/l萘乙酸的培养基在光照40-80mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为20-28下培养所述段，从普陀樟上胚轴切段诱导出原始不定芽；0013b)用上述含有ML培养基、0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.1-0.5mg/l萘乙酸、和大于0至0.01mg/l的噻二唑苯基脲的出芽培养基在光照40-80mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为20-28下培养所述原始不定芽，使所述原始不定芽生长成不定芽；0014c)用上述含有ML培养基，大于0，至0.6mg/l的6-苄氨基腺嘌呤，大于0，至0.06mg/l的萘乙酸和大于0至0.6mg/l的赤霉素的培养基在光照40-80mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为20-28下培养所述不定芽，使所述不定芽伸长，形成芽苗，再避光培养3-7天；0015d)分离单株所述芽苗，剥去小苗形态学下端叶片，用50mg/l IBA(吲哚丁酸)预处理0-36h后，用上述含有ML培养基和0.1-0.5mg/l吲哚丁酸的培养基加上2-5蔗糖(w/v)在光照60-100mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为20-28下诱导不定根，得到生根苗；0016e)将所述生根苗在光照60-100mol.m-2.s-1，12-20小时/天，温度为24-32下培养1-2周，在大气下培育得到普陀樟幼苗。 0017在该方面的一个优选例中，其中所述普陀樟上胚轴切段是通过将种子置于泥炭、菜园土和珍珠岩，其体积比为721的混合物上，在25-30下培养15-30天。 更优选的，在播种前将普陀樟果实用自来水浸泡1周，搓洗去掉表面肉质层，获得普陀樟种子；将种子在4-10的湿沙中沉积2月-2年后，置于22-28的湿介质上1-4周，保湿。 然后消毒，将上胚轴切成2-4毫米切段获得的。 0018在该方面的另一个优选例中，优选消毒是用水洗涤干净，用70体积酒精消毒30-90秒，用0.1-0.2体积升汞浸泡5-8分钟，用无菌水洗涤5-8次。 0019在该方面的另一个优选例中步骤a)、步骤b)中是在光照60mol.m-2.s-1，16小时/天，温度为231下培养。 0020在该方面的还有一个优选例中，步骤c)中是在光照60mol.m-2.s-1，16小时/天，温度为221下培养。 0021在该方面的甚至还一个优选例中步骤d)中是在光照80mol.m-2.s-1，16小时/天，温度为241下培养。 0022在该方法的另选一个优选例中，步骤e)中是在光照80mol.m-2.s-1，16小时/天，温度为282下培养。 在更优选的例子中，还包括在大气下加水10-20ml再培育5-8天。 0023该方法的另一个优选例中，还包括步骤f)将得到的普陀樟幼苗移栽到基质中，在22-32下生长成普陀樟再生植株。 优选基质是泥炭、菜园土和珍珠岩其体积比为说明书101933455A3/8页5721的混合物。 还优选生长是在282，自然光照下。 0024在本发明的第五个方面，还提供了上述含有ML培养基和0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤，0.1-0.5mg/l萘乙酸的培养基的用途，用于诱导普陀樟上胚轴长出不定芽。 0025在本发明的第六个方面，还提供了上述含有ML培养基、0.5-3mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.1-0.5mg/l萘乙酸、和至多为0.01mg/l的噻二唑苯基脲的培养基的用途，用于诱导不定芽伸长。 0026在本发明的第七个方面，还提供了上述含有1/2ML培养基和0.1-0.5mg/l吲哚丁酸的培养基的用途，用于诱导普陀樟不定芽生根。 0027在本发明的第八个方面，提供了ML培养基，其含有KNO31200mg/l；NH4NO3825mg/l；MgSO4.7H2O150mg/l；KH2PO4170mg/l；NH4Cl530mg/l；Ca(NO3)22H2O660mg/l；KCl65mg/l；H3BO36.2mg/l；ZnSO47H2O8.6mg/l；MnSO4H2O22.3mg/l；Na2MoO42H2O0.25mg/l；KI0.83mg/l；CuSO45H2O0.25mg/l；CoCl20.025mg/l；FeSO47H2O27.8mg/l；Na2EDTAH2O37.3mg/l；肌醇150mg/l；甘氨酸2.0mg/l；盐酸硫胺0.5mg/l烟酸0.2mg/l盐酸吡哆醇0.2mg/l；其中各组分含量可25。 0028在本发明的第九个方面，提供了1/2ML培养基，含有KNO3600mg/l；NH4NO3412mg/l；MgSO4.7H2O75mg/l；KH2PO485mg/l；NH4Cl265mg/l；Ca(NO3)22H2O330mg/l；KCl37mg/l；H3BO33.1mg/l；ZnSO47H2O4.3mg/l；MnSO4H2O11.15mg/l；Na2MoO42H2O0.125mg/l；KI0.415mg/l；CuSO45H2O0.125mg/l；CoCl20.013mg/l；FeSO47H2O13.9mg/lNa2EDTAH2O18.7mg/l；肌醇150mg/l；甘氨酸2.0mg/l；盐酸硫胺0.25mg/l；烟酸0.2mg/l；盐酸吡哆醇0.2mg/l；其中各组分含量可25。 附图说明0029图1A显示了上胚段切段的近子叶端开始膨大。 比例尺为2mm。 0030图1B显示了形态模糊的原始不定芽。 比例尺为4mm。 0031图1C显示了形态清晰的不定芽。 比例尺为6mm。 0032图1D显示了伸长的丛芽。 比例尺为8mm。 0033图1E显示了诱导出不定根的生根小苗。 比例尺为1cm。 0034图1F显示了再生植株。 比例尺为4cm。 具体实施方式0035发明人通过长期而深入的研究，找到了一种普陀樟(Cinnamomum japonicumvar.chenii)离体快繁的方法，即以普陀樟的上胚轴再生成植株。 本发明的方法通过培育条件的优化，克服了现有技术中自然条件栽培普陀樟种子发芽困难且栽培周期长的技术缺陷。 0036如本文所用，所述的“上胚轴”指子叶着生处以上的胚轴部分。 该普陀樟种子发芽而成的上胚轴可以任何，例如天然生成的(获自天然环境中的种子萌发)，或实验室条件诱导萌发生成的。 0037如本文所用的培养基中各成分的计量是以培养基总体积计。 0038植物离体培养成功的关键是找到适宜的培养基，确定最佳的培养条件。 0039植物激素是植物细胞、组织、器官离体培养中必不可少的物质，植物激素中的生长说明书101933455A4/8页6素和细胞分裂素是启动细胞脱分化、分裂和再分化的关键性激素，细胞分裂素/生长素比值高时有利于不定芽的分化，抑制根的分化。 本申请人通过大量试验，意外发现了适合普陀樟诱导不定芽的是细胞分裂素BA(6-苄氨基腺嘌呤)、TDZ(噻二唑苯基脲)和生长素NAA(素萘乙酸)。 以细胞分裂素BA(6-苄氨基腺嘌呤)为主，配合使用较低浓度的NAA(萘乙酸)和TDZ(噻二唑苯基脲)可十分有效地诱导普陀樟的上胚轴切段分化形成不定芽。 加入赤霉素后，可使不定芽得到有效伸长。 0040培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。 本领域常用的是MS培养基是组织培养过程中常用的培养基，特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。 其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。 它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。 由于其浓度较高，因此常用的是1/2MS或1/4MS培养基。 在本说明书实施例中使用的本发明使用的1/2MS培养基中各组分浓度如下硝酸铵825mg/l，硝酸钾950mg/l，磷酸二氢钾85mg/l，七水硫酸镁185mg/l，氯化钙440mg/l，七水硫酸亚铁27.8mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l，四水硫酸锰11.15mg/l，七水硫酸锌4.3mg/l，硼酸3.1mg/l，碘化钾0.415mg/l，二水钼酸钠0.125mg/l，五水硫酸铜0.0125mg/l，六水氯化钴0.0125mg/l，甘氨酸1mg/l，盐酸硫胺素0.25mg/l，盐酸吡哆素0.25mg/l，烟酸0.25mg/l，肌醇200mg/l，其中1/2MS培养基中各组分可含量25。 0041虽然在一般常规操作中常常使用MS培养基，但是本发明人经过摸索，配制了独特的ML培养基，该培养基特别适合普陀樟的生长。 使用常规的MS培养基，如下文实施例所示，其诱导生成普陀樟幼苗的效率仅是ML培养基的一半。 0042培养基中加入的有机成分主要有碳水化合物、维生素、肌醇、氨基酸、天然复合物等，还包括植物激素，选自生长素类，例如NAA(萘乙酸)等，还含有细胞分裂素类(cytokinin)，这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、Kt(kiin激动素)、ZT(zeatin玉米素)等。 其中Zt活性最强，但非常昂贵，在本发明中优选的是6-BA。 培养基中还包括支持物，例如琼脂等。 适当还可加入抗生物质抑菌。 还可加入抗氧化物。 0043在离体培养过程中，保证无菌状态也很重要。 对于原始的植株组织、工具和培养基都应进行消毒，例如使用70-75体积的酒精溶液，2-5体积的次氯酸溶液，0.1-0.2体积的升汞溶液，整个操作在无菌超净台中进行。 优选使用0.1体积的升汞溶液。 0044培养基中还可含有其它常规的成分，例如琼脂糖、抗菌物质等。 这些都是本领域技术人员可以常规确定的。 0045温度是植物离体培养中的重要因素，所以植物离体培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物离体培养都是在23-27之间进行，一般采用252。 低于15时培养，植物组织会表现生长停止，高于35时对植物生长不利。 但是，不同植物培养的适温不同。 对于主要生长在我国和亚洲其它地区的温带环境中的普陀樟，其最适合的温度是在20-30之间，最适温度为22-25。 在诱导和增殖阶段优选为231，在生根阶段，优选为241。 同时，在步骤e)中还包括提高培养温度从而使得生根苗耐受环境因素变化的步骤。 具体说，是在强度较大的光照条件下(60-100，优选80mol.m-2.s-1)，在282下(较高的温度)下培养1-2周。 说明书101933455A5/8页70046光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。 一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 本申请中诱导和生长阶段的光照强度为40-80mol.m-2.s-1，优选为60mol.m-2.s-1。 在生根阶段，可适当增加光照强度，优选为80mol.m-2.s-1。 0047在不同的组织培养阶段，光照时间视情况有所不同。 对于普陀樟来说，其光照时间一般为12-20个小时，优选16个小时。 0048在培养中为了保湿所采用的湿介质可以使用各种常规的方便获得且价格低廉的材料，例如纱布或牛皮纸等。 0049本发明的优点在于首次建立了普陀樟的离体培养方法。 并且，使用本发明的方法极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。 在短时间内可生产大量种苗，供应市场，获得经济效益，拯救濒危物种。 0050本发明的方法能够在短时间内生产大量的普陀樟优质种苗，而且这种种苗的发生不受季节限制，可以常年生产。 使用这种方法，人们便不再对自然界仅存的百来株母树进行掠夺性采种，从而起到保护该物种的作用。 0051本发明首次使普陀樟上胚轴培养成功再生成植株。 按本发明的方法重复三次试验，平均每个上胚轴切段能产生再生植株12.7株，且与亲本表型一致性高。 0052下文的实施例进一步说明了本发明，但需要注意它们不是为了特别限定。 0053实施例0054本实验中采用的试验材料为采自浙江舟山的普陀樟种子。 操作步骤如下0055 (1)基本培养基(Mulan basalmedium，简称ML培养基)的制备按照表1配制基本培养基，pH5.8，121灭菌15-25分钟。 不定芽的诱导和伸长均使用该培养基。 0056表1ML培养基的组成成分一览表说明书101933455A6/8页800570058 (2)将普陀樟果实用自来水浸泡1周，搓洗去掉表面肉质层，获得普陀樟种子。 将种子在4-10的湿沙中沉积2月-2年后，置于22-28的纱布上1-4周(注意保湿)，再将种子播种于泥炭、菜园土和珍珠岩(体积比为721，中国科学院植物生理研究所)的基质，28温室萌发15-30天后出苗。 0059 (3)将出苗7-15天的普陀樟实生苗用自来水洗净，吸干表面水珠，在超净工作台上用70的乙醇消毒30-90秒，0.1的升汞浸泡5-8分钟，无菌水冲洗5-8次，无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，将上胚轴切成2-4毫米的切段以备用。 0060 (4)将上胚轴切段接种于附含0.5-3mg/l BA(6-苄氨基腺嘌呤)和0.1-0.5mg/l NAA(萘乙酸)的ML培养基中培养7-15天后，上胚轴切段的近子叶端开始膨大(如图1A)，在此培养基上培养4-6周后，起始外植体基本上被致密的愈伤组织包裹。 培养条件光照(60mol.m-2.s-1)16h/d培养，培养温度为231。 说明书101933455A7/8页90061 (5)将步骤 (3)所得的致密的愈伤组织在附含0.5-3mg/l BA(6-苄氨基腺嘌呤)和0.1-0.5mg/l NAA(萘乙酸)的ML培养基上培养4-6周后，芽原基开始转变为形态模糊的原始不定芽(如图1B)。 光照(60mol.m-2.s-1)16h/d培养，培养温度为231，4周继代一次，培养基不变。 0062 (6)将附带原始不定芽的愈伤组织在附含0.5-3mg/l BA(6-苄氨基腺嘌呤)，0-0.01mg/l TDZ(噻二唑苯基脲)和0.1-0.5mg/l NAA(萘乙酸)的ML培养基上培养3-4周后，诱导出形态清晰的不定芽(如图1C)。 光照培养(60mol.m-2.s-1)16h/d，培养温度为231。 0063 (7)将不定芽转入附含0-0.6mg/l BA(6-苄氨基腺嘌呤)、0-0.06mg/l NAA(萘乙酸)和0-0.6mg/l GA3(赤霉素)的ML培养基培养4-6周后，不定芽得到有效伸长(如图1D)，光照(60mol.m-2.s-1)16h/d，培养温度221。 0064 (8)将伸长的芽苗在步骤 (6)的培养基中暗培养(221)3-7天。 0065 (9)将暗培养后的芽苗分离成单株，剥去小苗形态学下端叶片，用